[发明专利]一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用

说明书

一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过定点突变的方法，将乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸变为天冬氨酸，将乙酰丙酮裂解酶突变体用于乙酰丙酮的合成后，提高了乙酰丙酮的产量，达到86.7mg/L，本发明对乙酰丙酮裂解酶的工程改造和乙酰丙酮的生物合成提供了良好范例。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用。

背景技术

乙酰丙酮，又名2,4-戊二酮（CAS NO. 123-54-6）。其广泛应用于燃料添加剂、染料中间体、树脂改性剂、金属提炼等，国内90％的乙酰丙酮用于医药和兽药的生产。近年来，乙酰丙酮下游医药出口形势越来越好，需求得到快速增长。当前乙酰丙酮的生产，主要是以化学合成法为主。但化学合成乙酰丙酮步骤繁琐，存在能耗高（500-600℃）、污染重等瓶颈问题，不符合当今低碳经济的需求。

生物法合成效率高、能耗低、能够避免大量污染物的生成，和化学法相比优势明显。但乙酰丙酮的生物合成方法尚未引起广泛关注。乙酰丙酮可以被约翰逊不动杆菌Acinetobacter johnsonii降解利用，但是可逆反应是否能实现，还没有相关研究。在中国专利CN201810865467.0中，通过对来自Acinetobacter johnsonii的乙酰丙酮裂解酶基因核苷酸序列进行优化，在大肠杆菌体内过表达后，首次实现了乙酰丙酮的生物合成。但是，乙酰丙酮的合成效率还比较低，产量只有53mg/L。

发明内容

为了提高生物法合成乙酰丙酮的合成效率，本发明提供了一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用。具体技术方案如下：

一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体，所述乙酰丙酮裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，是将SEQ ID NO.3所示乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸替换为天冬氨酸获得的。

本发明还提供了编码上述乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸，所述核苷酸序列为下述的一种：

1). SEQ ID No.2所示核苷酸序列；

2). 与SEQ ID No.2所示核苷酸序列互补的核苷酸序列；

3). 与1)或2)所述核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与1)或2)的核苷酸序列不同的核苷酸序列。

本发明还提供了含有上述核苷酸序列的重组载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体的出发质粒为pETDuet-1。

本发明还提供了含有上述核苷酸序列的重组菌。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌的出发菌株为大肠杆菌。

本发明还提供了上述乙酰丙酮裂解酶突变体在生产乙酰丙酮中的应用。

本发明还提供了上述编码乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸在生产乙酰丙酮中的应用。

本发明还提供了上述重组载体在生产乙酰丙酮中的应用。

本发明还提供了上述重组菌在生产乙酰丙酮中的应用。

在本发明的一个实施例中，生产乙酰丙酮的方法如下：将重组菌菌株接种到发酵培养基中（内含100μg·mL-1氨苄青霉素），30～37℃，振荡培养至OD600为0.5-0.8，然后加入 IPTG进行诱导24-72h，制备获得生产乙酰丙酮。

优选地，上述生产乙酰丙酮的方法如下：将重组菌菌株接种到发酵培养基中（内含100μg·mL-1氨苄青霉素），30℃，振荡培养至OD600为0.6，然后加入 IPTG进行诱导24h，制备获得生产乙酰丙酮。