[发明专利]一种印迹脂肪酶及其应用

说明书

本发明公开了一种印迹脂肪酶及其应用。本发明公开一种制备印迹脂肪酶的方法，包括以高光学纯度L‑乳酸作为印迹模板对脂肪酶进行生物印迹的步骤。本发明将该印迹脂肪酶用于发酵制备L‑乳酸，得到的L‑乳酸光学纯度高，并且不需要对菌株进行改造，操作简便，成本低廉，能够适用于高光学纯度L‑乳酸的工业化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种印迹脂肪酶及其应用，特别是印迹脂肪酶在发酵法制备高光学纯度L-乳酸中的应用。

背景技术

乳酸，又称α-羟基丙酸，是自然界中的三大有机酸之一，作为一种重要原料被广泛地应用于食品、药品、化工和材料等领域。近年来，随着温室效应和环境污染的加剧，由乳酸单体聚合制备的聚乳酸(PLA)材料广泛受到人们的关注。聚乳酸能够在特定条件下降解为小分子，产生二氧化碳和水，能够缓解白色污染造成的环境压力，改善生态环境。并且聚乳酸安全无毒，抗菌透气，具有良好的力学性能和加工性能，可用于食品包装袋、餐盒、纺织品、工程塑料等。因此，聚乳酸材料已经逐渐成为一项市场广阔的可降解塑料产品。乳酸按照旋光度可以分为L型和D型，乳酸单体的光学纯度决定着聚乳酸的物理性质和使用性能，一般要求单体的光学纯度达到99.5％以上。因此随着生物可降解塑料的推广，高光学纯度L-乳酸的需求量也将逐渐增大。

目前，L-乳酸的主流制备方法为发酵法。某些微生物(如乳酸杆菌、芽孢杆菌、米根霉等)在特定的温度和通氧条件下将葡萄糖或淀粉原料转化为乳酸产品。与化学法相比，发酵法具有原料成本低、环保、低污染等优势。但是，微生物在发酵过程中的代谢产物比较复杂，除了L-乳酸之外还有少量D-乳酸，它们会影响乳酸的光学纯度，进而影响聚乳酸的品质和应用性能。通过普通的化工分离单元操作很难将光学异构体分开。

手性拆分，是指通过合适的拆分方法来分离光学异构体混合物，得到需要的手性物质的构型的方法。手性拆分方法主要有色谱法、酶法、结晶法、化学拆分法等等，其中酶法拆分是指利用酶的特异性与酶与光学异构体之间能相互识别，先生成不同的衍生化合物，再把异构体相互分开，该方法具有众多的优点：商业酶种类广泛选择多、成本低廉，在有机溶剂中稳定性好、选择性高，催化条件温和、环境污染小，操作简便等。以往的酶法拆分主要是应用天然酶分子，例如用青霉素酰化酶制备(S)-2-氨基丁醇，天然酶分子受限于种类，能够制备的产品种类很少。近年来，随着分子印迹酶技术的快速发展，酶可以“记忆”目标分子的构型，从而制备更多种类构型的分子。生物印迹首先将酶与模板分子共溶于溶液中，使得酶改变构象与配体有机结合，处于激活状态，然后通过冷冻干燥或固定化技术将这种活性构象固定，再将模板洗去。最终得到的生物印记酶可保持这一高活性构象。生物印迹酶的最大优势在于可以“按需设计”其结构，可根据目标产物的需求，对印迹模板进行筛选，从而得到具有更高特异选择性的印迹酶。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是现有的乳酸发酵产品中L-乳酸光学纯度较低(一般只有98％)，杂质含量多，分离困难的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种制备印迹脂肪酶的方法，包括以高光学纯度L-乳酸作为印迹模板对脂肪酶进行生物印迹的步骤；

所述高光学纯度L-乳酸的光学纯度为99.5％以上。

在一个实施方案中，上述方法中，所述生物印迹包括将所述脂肪酶溶解在缓冲液中，加入所述高光学纯度L-乳酸作为印迹模板，混匀，冷冻后冻干，再加入碳原子数为1-4的醇洗涤除去印迹模板，同时沉淀得到印迹脂肪酶的步骤。

在一个实施方案中，上述方法中，所述脂肪酶与所述高光学纯度L-乳酸的质量比为1:5-3:1。

在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述脂肪酶与所述缓冲液的质量体积比为10mg:1ml-50mg:1ml。

在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述碳原子数为1-4的醇与所述缓冲液的体积比为5:1-10:1。