[发明专利]基于生物适配体的催化发夹自组装反应检测水环境中3,3′,4,4′-四氯联苯的方法

说明书

本发明涉及一种基于生物适配体的催化发夹自组装反应检测水环境中3,3′,4,4′‑四氯联苯的方法，主要通过PCB77的适配体与引物合成识别探针，在PCB77的存在条件下，适配体与PCB77结合形成稳定的结构，并释放出引物链，无酶催化发夹自组装反应被激活，引物链与发夹探针H1杂交产生双链结构，启动链置换反应打开发夹探针H2，产生荧光信号；引物链从发夹探针H1与H2上掉落，循环反应，使荧光信号扩大，获得荧光数据，绘制标准曲线，检测水体样本PCB77获得荧光数据，计算出水体样本中PCB77的含量；本发明涉及的方法操作简单，检测结果准确灵敏度高。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，是基于生物适配体的催化发夹自组装反应检测水环境中3,3′,4,4′-四氯联苯的方法。

背景技术

多氯联苯是无色或淡黄色的油性物质。根据氯原子取代的数量和位置，理论上有209个同系物，已确定结构的有109种。因其化学性质，物理特性和毒性与DDT非常相似，且在自然环境中很难降解，存留时间较长，可以通过大气、水的输送而影响到区域和全球环境。又由于多氯联苯对脂肪具有很强的亲和性，因此可通过食物链浓缩造成对人体的潜在危害，产生积累性中毒，严重影响人类健康。随着多氯联苯的逐步消除、减少和控制，多氯联苯仍然存在于电力、塑料加工、化工、印刷等行业，由于其良好的化学惰性、耐热性、不燃性和高介电常数，在自然界中广泛存在。其中，3,3′,4,4′-四氯联苯(PCB77)是一种典型的共面多氯联苯同系物，具有很强的生物毒性，可引起癌症等不良的健康影响，可做为一种水环境中的重点检测目标。

传统的多氯联苯检测方法通常采用气相色谱-质谱联用和高效液相色谱-质谱联用。色谱分析方法具有灵敏度高、精确性好、重复性高等特点，在当前的仪器分析方法中占据了主导的地位。但是，由于该方法需要昂贵的仪器设备和专业技术人员准确操作，分析成本高，分析周期长，因此大范围使用受到限制。同时，由于环境样品中有机污染物的样品也种类多样需要复杂的前处理，对单一有机污染物的实时定量监测十分困难。还有一类基于免疫的PCB77检测方法，如基于免疫聚合酶链反应检测、基于免疫的表面等离子体共振检测、基于免疫的电化学磁传感器检测等。但是，这些方法的特异性较低，且操作比较复杂。因此，有必要进一步提高PCB77检测传感器的灵敏度和方便性。

中国文献《多氯联苯特异性分子探针筛选和基于适配体的纳米生物传感器研究》(徐升敏，中国科学院大学，博士论文，2012年11月)，该论文涉及了基于适配体的金纳米颗粒检测PCB77的研究，公开了通过筛选得到的识别PCB77的DNA适配体，结合金纳米颗粒，设计了两种纳米生物探针，基于荧光的恢复法制备的分子探针，再痕量检测PCB77方面有很好的灵敏度，最低检测限为0.5μg/L，该文献公开了识别PCB77的DNA适配体，但是并未涉及利用催化发夹自组装反应检测方法用于检测PCB77。

中国文献《DNA发夹结构自组装信号放大在产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌检测中应用的研究》(俞蓓，南昌大学，硕士论文，2018年5月26日)公开了催化发夹型DNA自组装反应(catalyzed hairpin assembly，CHA)，本文公开DNA发夹结构自组装反应，是利用检测底物在蜡样芽孢杆菌中对应的基因序列，设计目标引物，在DNA发夹结构自组装反应过程中只是同过目标引物激活探针信号反应，并未涉及引物与检测底物的结合问题；虽然该文献中给出利用DNA发夹结构自组装信号放大的方法可以检测多种物质的其它参考文献，通过对比相关文献可以看出，虽然最后都是激活探针信号，但在激活探针信号之前涉及检测底物的关键反应各不相同，有的是直接利用目标引物激活探针信号，在激活探针的反应体系中不含检测底物，有的是利用与底物结合后的适配体激活探针信号等等，在激活探针信号之前的反应检测底物不同，反应原理也各不相同，不同检测底物的反应都有各自的特异性；进一步的由于前期的反应原理不同，相对应的发夹探针也各不相同，并且该文献明确说明了在基于DNA发夹结构自组装信号放大策略的生物分子检测中，仍存在一些问题亟待解决，包括如下问题：DNA发夹结构自组装信号放大效率与发夹探针的设计有关，目前针对探针对发夹探针设计的具体操作鲜有报道；单独使用DNA发夹结构自组装信号放大策略实现高灵敏度检测的并不多。