[发明专利]基于生物适配体的催化发夹自组装反应检测水环境中3,3′,4,4′-四氯联苯的方法

权利要求书

1.基于生物适配体的催化发夹自组装反应检测水环境中PCB77的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

（1）识别探针合成：将PCB77的适配体与引物按照摩尔比1：1的比例加入到1×TBE缓冲液中，混合均匀；将混合液加热至80~95 ℃，恒温3~5 min；然后将混合液缓慢冷却至室温，室温冷却时间为30~60 min；

所述步骤（1）中PCB77的适配体序列为：5′-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTGGTGCCC-3′SEQ ID

NO.1；

所述步骤（1）的引物序列为：

5′-ACGGGCCATCGGAAAAAATCACTA-3′ SEQ ID NO.2；

（2）发夹探针合成：将发夹探针H1与发夹探针H2各自加入到1×TBE缓冲液中，混合均匀，将各自的混合溶液加热至80~95 ℃，恒温3~5 min，然后置于冰上，反应时间为3~5 min，最后置于室温，反应时间为30~60 min；

所述步骤（2）中的发夹探针H1序列为：

5′-CACGAGACTGTTCACATCGGAAAAAATCACTAAGATGTGTACCTAGTGATTTTTT

CCGATGGCCCGT-3′SEQ ID NO.3；

所述步骤（2）中的发夹探针H2序列为：

5′-/Cy-5/AGATGTGTACCTCGGAAAAAATCACTAGGTACACATC/BHQ-2/TTAGT

GATT-3′SEQ ID NO.4；

（3）荧光测定水样中PCB77含量，包括如下步骤：

①将步骤（1）中的识别探针和步骤（2）中的发夹探针H1与发夹探针H2按照摩尔比1：（1~1.5）：（1~1.5）的比例混和均匀制得混合液；

②向步骤①制得的混合液中加入PCB77标准溶液，再用结合缓冲液定容，制备成不同浓度的检测液I，然后，将检测液I加热至30~60 ℃，反应时间为1~2 h；反应完成后，用荧光仪测定检测液I的荧光强度，获得荧光数据，绘制标准曲线；

所述荧光数据是于激发波长635 nm、发射波长660 nm下测得的；

所述结合缓冲液包括如下组分：NaCl的质量浓度为100~150 mM，Tris-HCl的质量浓度为10~20 mM，MgCl₂的质量浓度为1~5 mM，KCl的质量浓度为1~5 mM，CaCl₂的质量浓度为1~2mM，余量为双蒸水；

③实际水样中PCB77含量的检测：按照步骤②的步骤进行检测，向步骤①制得的混合液中加入实际水样或者实际水样的稀释液制得检测液II，代替PCB77标准溶液，获得荧光数据，并根据步骤②制备的标准曲线，计算出实际水样中PCB77的质量浓度。

2.如权利要求1所述检测水环境中PCB77的方法，其特征在于，步骤（1）中的加热温度为80 ℃，恒温时间为3 min，室温冷却时间为30 min。

3.如权利要求1所述检测水环境中PCB77的方法，其特征在于，步骤（2）中的加热温度为80 ℃，恒温时间为3 min ,置于冰上，反应时间为3 min，最后置于室温，反应时间为30min。

4.如权利要求1所述检测水环境中PCB77的方法，其特征在于，步骤①中识别探针和发夹探针H1与发夹探针H2按照摩尔比1：1：1的比例混合。

5.如权利要求1所述检测水环境中PCB77的方法，其特征在于，步骤②中结合缓冲液包括如下组分：NaCl的质量浓度为100 mM，Tris-HCl的质量浓度为10 mM，MgCl₂的质量浓度为1 mM，KCl的质量浓度为1 mM，CaCl₂的质量浓度为1 mM，余量为双蒸水。

6.如权利要求1所述检测水环境中PCB77的方法，其特征在于，步骤②中反应温度为30℃，反应时间为1 h。