[发明专利]一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法有效
| 申请号： | 202010212266.8 | 申请日： | 2020-03-24 |
| 公开（公告）号： | CN111269875B | 公开（公告）日： | 2022-04-08 |
| 发明（设计）人： | 刘明录;强邦明;韩庆梅;王立新;张传鹏;金海锋;卢永灿;冯建海;李希鹏 | 申请（专利权）人： | 山东兴瑞生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071;C12N5/10 |
| 代理公司： | 山东华君知识产权代理有限公司 37300 | 代理人： | 武欢欢 |
| 地址： | 261500 山东*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 利用 免疫 细胞 定向 化为 胰岛 方法 | ||
1.一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，其特征在于：所述方法为从患者外周血获取免疫细胞经体外去分化为诱导多能干细胞，再定向分化生成胰岛细胞；
所述定向分化生成胰岛细胞，包括诱导多能干细胞定向分化诱导生成内胚层细胞、诱导分化为原肠管细胞、诱导分化为胰腺祖细胞、诱导分化为胰腺内皮层细胞、诱导分化为胰岛细胞；
所述诱导多能干细胞定向分化诱导生成内胚层细胞，用含CHIR99021化合物的S1培养基进行培养，培养22-26h后，更换新鲜的S1培养基，培养48-70h获得定型内胚层细胞；
所述S1培养基为DMEM低糖培养基，另含有95-105ng/mL的Activin A，体积百分比为1-3%的B27；所述含CHIR99021化合物的S1培养基，CHIR99021化合物的浓度为13-15 ug/ml；
所述诱导分化为原肠管细胞，将内胚层细胞使用S2培养基进行培养，培养68-76h获得原肠管细胞；所述S2培养基，为DMEM低糖培养基，另含有45-55ng/mL的KGF，体积百分比为1-3%的B27；
所述诱导分化为胰腺祖细胞，由原肠管细胞继续诱导分化为胰腺祖细胞，分为两个阶段，第一阶段为诱导早期胰腺祖细胞，先在含有190-210nM LDN193189的S3培养基培养22-26h，更换S3培养基培养24-48h；第二阶段将早期胰腺祖细胞诱导成为胰腺祖细胞，使用S4培养基，培养4-6天；
所述S3培养基为DMEM/F12培养基，另含有45-55ng/mL的KGF、0.24-0.26uM的SANT1、490-510nM的PdbU、9.5-10.5uM的Y27632、1.9-2.1uM的RA、体积百分比为1-3%的B27；
所述S4培养基为DMEM/F12培养基，另含有45-55ng/mL的KGF、0.24-0.26uM的SANT1、4.5-5.5ng/ml的Activin A、9.5-10.5uM的Y27632、95-105nM的RA、体积百分比为1-3%的B27；
所述诱导分化为胰腺内皮层细胞，将胰腺祖细胞，在S5培养基中培养4-5天，诱导分化为胰腺内皮层细胞；所述S5培养基为DMEM高糖培养基，另含有0.24-0.26uM的SANT1、95-105nM的RA、0.95-1.05uM的XXI、9.5-10.5uM的SB431542、0.9-1.1uM的T3、19-21ng/mL的Betacellulin、体积百分比为1-3%的B27；
所述诱导分化为胰岛细胞，使用的培养基为包含9.5-10.5uM 的SB431542和0.9-1.1uM的T3的CMRL1066培养基，培养4-7天。
2.根据权利要求1所述的一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，其特征在于：所述诱导多能干细胞，纯度≧95%。
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