[发明专利]CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统

说明书

本发明公开了一种CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统，属于基因工程技术领域。本发明基于CRISPR/Cas9基因打靶系统实现了内源核糖体结合位点和外源启动子的联合，构建了附加lRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统；同时联合孢子种间结合转移，提高了阳性突变株得率，从而显著提高了微生物次级代谢产物的产量。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统。

背景技术

微生物次级代谢产物其结构复杂多样，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫抑制等多种生物活性，是微生物药物开发的源泉。由于次级代谢产物不是细胞生长必须的，进化过程中，细胞产生的次级代谢产物的产量只需满足其特殊的生理功能，产量较低。但是，在工业生产时，这种低产量远不能达到产业化要求。

代谢工程是目前提高次级代谢产物产量行之有效的方法。微生物次级代谢产物启动子工程是代谢工程研究中精细调控关键基因表达的重要工具。启动子工程，是借助基因表达元件，调节路径酶的差异表达，实现代谢流平衡，从而提高细胞工厂的生产效率。其中调控核糖体结合位点(RBS)强度是启动子工程常用的路径优化控制策略之一。RBS序列是控制翻译起始和蛋白质表达的关键区域，是多种微生物蛋白质翻译的重要遗传因子，因此决定着翻译水平的高低。研究表明运用合适的RBS可以增强相关蛋白质的表达，调控代谢流，提高目的产物的产量。因此通过改变目标蛋白质编码基因前的RBS序列，获得不同翻译水平的蛋白质或酶，从而可以调控代谢流，获得相应的代谢产物。然而，目前对于来源于次级代谢产物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster，简称BGC)的内源性RBS(local RBS，简称lRBS)与来源于外源性强启动子中的RBS相结合，从而形成双重RBS(double-RBS，简称dRBS)的增强效果研究还处于技术空白。

启动子工程为激活原始沉默生物合成基因簇和发现新的天然产物的重要技术。kasO*P是一个构造简单且具有很强的功能的工程启动子，在链霉菌相关次级代谢产物合成基因簇表达中有很多成功案例。虽然启动子工程对微生物次级代谢产物的提升起到了很大的帮助，但是常用的启动子工程的方法对于提高产物的效价还是没有达到一个满意的程度。

目前在稀有放线菌Nonomuraea中，基因编辑仍然存在很多问题。一方面，稀有放线菌Nonomuraea的产孢能力差，目前通常采用菌丝体与大肠杆菌进行接合作用导入外源基因。然而，由于死亡的菌丝体与接合转移子形态相似，因此很难在平板中对阳性突变株进行筛选区分。另一方面，由于Nonomuraea的修饰限制系统作用较强，也造成了外源基因的转化效率极低，从而造成基因打靶失败，构建突变株难度较大。目前，基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术已经应用于包括链霉菌在内的多种微生物中，单质粒CRISPR/Cas9-codA(sm)系统是其中一种。它包含了化脓链球菌Cas9基因，靶向特异性sg-RNA，另外codA(sm)作为一种有效的反选择方法可以辅助打靶质粒的丢失，提高获得突变株的效率。但是，目前在稀有放线菌Nonomuraea中尚没有成功案例。

发明内容

针对上述现有技术，本发明基于CRISPR/Cas9基因打靶系统实现了内源核糖体结合位点和外源启动子的联合，构建了附加lRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统；然后联合孢子种间结合转移，提高了阳性突变株得率，从而显著提高了微生物次级代谢产物的产量。

本发明的第一方面，提供一种具有sRBS的强启动子kasO*P系统，包括：

含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性sg-RNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以及构建于所述CRISPR/Cas9基因编辑载体中的启动子盒；所述启动子盒包含上游同源臂、kasO*P和下游同源臂；所述kasO*P的序列如SEQ ID NO.15所示。