[发明专利]CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统

权利要求书

1.含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统在提高稀有放线菌Nonomuraea的次级代谢产物中ecumicin的产量中的应用；其特征在于，

所述含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统由如下方法构建而成：

(1)利用信息学手段来确定lRBS位点，在mRNA的起始密码子上游8-13核苷酸处，存在一段由4-9个核苷酸组成的共有序列AGGAGG；

(2)利用CasOT软件在合成起始基因的lRBS位点上游附近寻找目的打靶的特异性20bpsg-RNA序列并体外合成；

(3)通过BaeⅠ限制酶酶切位点将目标基因的特异性sg-RNA序列克隆进入CRISPR/Cas9基因编辑载体中；所述特异性sg-RNA序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

(4)通过PCR分别扩增获得打靶基因的上游同源臂、下游同源臂和启动子基因kasO*P；

所述上游同源臂由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物扩增得到；所述下游同源臂由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物扩增得到；所述启动子基因kasO*P由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增得到；

(5)采用重叠PCR方法组装含有上游同源臂、kasO*P和下游同源臂的启动子盒，然后通过同源重组融合方法将其构建于步骤(3)的含有特异性sg-RNA序列的基因组编辑载体中。

2.一种提高微生物次级代谢产物ecumicin产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统转化至野生稀有放线菌Nonomuraea内，获得阳性突变菌株；

将阳性突变菌株进行发酵培养，获得次级代谢产物，所述次级代谢产物的产量高于野生稀有放线菌Nonomuraea发酵培养所获得的次级代谢产物ecumicin的产量；

发酵培养所采用的培养基的组成为：葡萄糖3.0％，可溶性淀粉6.0％，玉米粉0.3％，棉花种子粉0.6％，酵母提取物0.3％，大豆粉2.0％，(NH₄)₂SO₄ 0.1％，CaCO₃ 0.3％,K₂HPO₄0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.86％，CaCl₂ 0.01％，FeSO₄ 0.001％，CoCl₂·6H₂O 0.01％，L-Valine 0.05％；

所述含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统由如下方法构建而成：

(1)利用信息学手段来确定lRBS位点，在mRNA的起始密码子上游8-13核苷酸处，存在一段由4-9个核苷酸组成的共有序列AGGAGG；

(2)利用CasOT软件在合成起始基因的lRBS位点上游附近寻找目的打靶的特异性20bpsg-RNA序列并体外合成；

(3)通过BaeⅠ限制酶酶切位点将目标基因的特异性sg-RNA序列克隆进入CRISPR/Cas9基因编辑载体中；所述特异性sg-RNA序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

(4)通过PCR分别扩增获得打靶基因的上游同源臂、下游同源臂和启动子基因kasO*P；

所述上游同源臂由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物扩增得到；所述下游同源臂由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物扩增得到；所述启动子基因kasO*P由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增得到；

(5)采用重叠PCR方法组装含有上游同源臂、kasO*P和下游同源臂的启动子盒，然后通过同源重组融合方法将其构建于步骤(3)的含有特异性sg-RNA序列的基因组编辑载体中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：30℃，220rpm，振荡培养8天。