[发明专利]一种利用甘油制备4-乙基苯酚的方法

说明书

本发明公开一种利用甘油制备4‑乙基苯酚方法，属于生物工程技术领域。该方法在大肠杆菌中构建了4‑乙基苯酚的生物合成途径：以甘油为底物，在大肠杆菌中通过糖酵解途径和莽草酸途径合成酪氨酸，然后在酪氨酸氨解酶催化作用下，酪氨酸被转化为对香豆酸，随后，对香豆酸在酚酸脱羧酶的催化下生成4‑乙烯基苯酚。最后，在苯酚还原酶的催化下，4‑乙烯基苯酚被转化为4‑乙基苯酚。本发明提供了一个新的4‑乙基苯酚生产途径，该方法具有生产成本低，生产能耗低，环境污染小等优点，也为将来的大规模工业应用奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及利用甘油制备4-乙基苯酚的方法。

背景技术

由于化石燃料资源的枯竭以及对传统石化工业可持续发展的关注，生物可再生燃料和化学制品受到越来越多的关注。随着代谢工程的发展和新代谢途径的发现，以前难以从大自然中获得的化合物可以通过微生物的生物合成而获得。生物合成法与传统的化学合成法相比，具有反应条件温和，底物亲和性好，以及不影响环境等优点，且生物法合成的产物可以看作是天然产物，可直接用于食品与医药行业。近年来，不少研究者们在微生物中(如大肠杆菌，酿酒酵母等)建立了人工生物合成途径，以葡萄糖或甘油作为可再生底物，来获取高价值的芳香族化合物及其衍生物，例如肉桂酸，对香豆酸，咖啡酸，阿魏酸，香兰素、4-乙烯基苯酚、苯乙烯等。

4-乙基苯酚，英文名4-Ethylphenol，分子式C₈H₁₀O，分子量122.16，CAS号：123-07-9。4-乙基苯酚是芳香族化合物的衍生物，为无色或白色结晶，可因光照而变黄，具有强烈木酚气味，广泛用作食品香料，酚醛树脂，抗氧化剂等。4-乙基苯酚还是重要的有机合成中间体和化学药品试剂，可以通过热解催化从生物质中提取。当前4-乙基苯酚的工业生产仅依赖于石化工业，主要包括三个步骤，即乙苯磺化以生产乙苯磺酸混合物，分离对乙苯磺酸和最后用碱融合以获得4-乙基苯酚，但是该过程复杂且对环境不利。因此，生物技术方法将是可持续生产4-乙基苯酚的替代方法，但是目前还没有发现微生物从简单碳源生物合成4-乙基苯酚然的代谢途径。申请人基于我们大量的前期研究，基于合成生物学原理，在大肠杆菌中人工构建了由三种酶---酪氨酸氨解酶、酚酸脱羧酶和苯酚还原酶组成的4-乙基苯酚的人工生物合成途径：以甘油为底物，在大肠杆菌中通过糖酵解途径和莽草酸途径合成酪氨酸，然后在酪氨酸氨解酶催化作用下，酪氨酸被转化为对香豆酸，随后，对香豆酸在酚酸脱羧酶的催化下生成4-乙烯基苯酚，4-乙烯基苯酚在苯酚还原酶作用下生成4-乙基苯酚。

发明内容

针对传统化学合成4-乙基苯酚过程中成本高，能耗高，环境污染重等不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，以甘油为底物，通过在大肠杆菌中构建4-乙基苯酚的人工合成途径，实现从甘油到4-乙基苯酚的生产；该方法具有条件温和，生产成本低，环境污染小等优点。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，先在微生物中构建出4-乙基苯酚的合成途径，然后以甘油为底物进行微生物发酵，制备出4-乙基苯酚；所述的合成途径为：以甘油为底物，通过糖酵解途径和莽草酸途径合成酪氨酸，然后酪氨酸在酪氨酸解氨酶作用下生成对香豆酸，对香豆酸在酚酸脱羧酶作用下生成4-乙烯基苯酚，4-乙烯基苯酚在苯酚还原酶作用下生成4-乙基苯酚。

所述的微生物为大肠杆菌。

所述的合成途径包括三个基因的异源表达，包括来自Saccharothrixespanaensis的酪氨酸解氨酶基因setal、来自Bacillus atrophaeu的酚酸脱羧酶基因bapad和来自Lactobacillusplantarum的苯酚还原酶基因。

所述的三个基因的异源表达为将三个基因克隆到同一表达载体pETDuet-1中，得到重组质粒pETDuet-tal-pad-vpr。

发酵温度为37℃。