[发明专利]一种利用甘油制备4-乙基苯酚的方法

权利要求书

1.一种利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，其特征在于，先在微生物中构建出4-乙基苯酚的合成途径，然后以甘油为底物进行微生物发酵，制备出4-乙基苯酚；所述的合成途径为：以甘油为底物，通过糖酵解途径和莽草酸途径合成酪氨酸，然后酪氨酸在酪氨酸解氨酶作用下生成对香豆酸，对香豆酸在酚酸脱羧酶作用下生成4-乙烯基苯酚，4-乙烯基苯酚在苯酚还原酶作用下生成4-乙基苯酚；所述的微生物为大肠杆菌；所述的合成途径包括三个基因的异源表达，包括来自Saccharothrix espanaensis的酪氨酸解氨酶基因setal、来自Bacillus atrophaeu的酚酸脱羧酶基因bapad和来自Lactobacillusplantarum的苯酚还原酶基因。

2.根据权利要求1所述的利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，其特征在于，所述的三个基因的异源表达为将三个基因克隆到同一表达载体pETDuet-1中，得到重组质粒pETDuet-tal-pad-vpr。

3.根据权利要求1所述的利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，其特征在于，发酵温度为37℃。

4.根据权利要求1所述的利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将编码酪氨酸解氨酶的基因tal，编码酚酸脱羧酶的基因pad和编码苯酚还原酶的基因vpr，克隆到大肠杆菌表达载体pETDuet-1中，构建重组质粒pETDuet-tal-pad-vpr；

(2)将重组质粒pETDuet-tal-pad-vpr分别转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和E.coliTransB(DE3)，得到重组菌E.coli BL21-TPV和E.coli TransB-TPV；

(3)将重组菌在LB培养基中37℃培养过夜，之后按2％的接种量接入100mL TB培养基，向培养基中添加或不添加渗透剂，37℃培养至OD600为0.8时加入终浓度为0.2mM的IPTG，在20～37℃培养72h；每隔12h取样测产物4-乙基苯酚的浓度。

5.根据权利要求4所述的利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，其特征在于，步骤(1)中，主要构建步骤如下：

1)以pET21b-setal为模板，以setal-F和setal-R为引物，对setal的序列进行PCR扩增；将setal-PCR片段克隆到载体pETDuet-1中，酶切位点为SacI和NotI，生成pETDuet-setal；

2)以pET28a-bapad作为模板并以bapad-F和bapad-R作为引物对bapad的序列进行PCR扩增；用NdeI和XhoI消化bapad-PCR片段，并将其克隆到pETDuet-setal的相应位点以构建pETDuet-setal-bapad；

3)以pET21b-lpvpr为模板，用T7-N和vpr-C为引物对含有T7启动子，核糖体结合位点(RBS)和vpr基因的片段进行PCR扩增；扩增的片段用限制性内切酶XhoI和PacI消化，并插入载体pETDuet-setal-bapad的相应位点中，得到重组质粒pETDuet-tal-pad-vpr。

6.根据权利要求4所述的利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，其特征在于，步骤(2)中，构建得到的重组菌为E.coli TransB-TPV。

7.根据权利要求4所述的利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，其特征在于，步骤(3)中，添加渗透剂，渗透剂为1M的山梨醇和2.5mM的甜菜碱。

8.根据权利要求4所述的利用甘油制备4-乙基苯酚的方法，其特征在于，步骤(3)中，在20℃诱导16h后转入37℃中再培养72h。