[发明专利]用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT‑LAMP试剂盒及其专用引物和应用，属于生物技术检测领域。提供的用于检测黄热病毒疫苗株的RT‑LAMP引物能够实现对黄热病毒疫苗株的特异性检测和鉴别，提供的RT‑LAMP试剂盒的检测操作简单、特异性强、灵敏度高，可以快速且高效对黄热病毒疫苗株进行检测和鉴别，可以用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和鉴别黄热病毒疫苗株。

技术领域

本发明属于生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测专用引物和检测试剂盒。

背景技术

黄热病毒(Yellow fever virus)是黄病毒科(Flaviridae)，黄病毒属(Flavivirus)的单股正链RNA病毒。病毒经蚊虫传播，传播媒介主要为埃及伊蚊，临床特征有发热、剧烈头痛、黄疸、出血和蛋白尿等，目前主要在非洲及南美洲流行。人群对黄热病毒疫苗株较为易感，病死率可达20％-40％，是国际三大检疫传染病之一，目前通过接种黄热病毒减毒活疫苗来控制黄热病的流行。目前使用的疫苗株为Theiler和Smith在1936年减毒的Asibi株，命名为17D株，并在17D株的基础上进一步传代减毒，衍生出现代生产黄热疫苗所使用的17D-204(欧美国家使用)，17D-213和17DD疫苗株(巴西使用)。黄热减毒疫苗已为世界大面积人群提供了近50年的保护力，是疫苗史上最安全有效的减毒活疫苗之一。

虽然目前我国未见有黄热病的大规模流行，但我国某些地区的地理条件和气候条件与黄热病高发区域相似，也存在发病的可能性。在过去的20多年里，黄热病感染者逐年增加，据世界卫生组织(WHO)估计，每年至少有20万黄热病病例，造成3万人死亡，严重威胁到人们的健康。目前，黄热病毒减毒疫苗已在世界范围内大量使用，因此在检疫口岸，需要结合黄热病毒的检测以及黄热病毒疫苗株的鉴定，以快速判断该病毒是否为输入性感染病例或是否为新感染病例，及时对感染病例采取相应的处置措施，可将外来感染阻挡于国门之外。

因此需要建立黄热病毒疫苗株的快速、灵敏检测鉴别方法，以快速区分是否为输入性感染病例或新感染病例，能够尽早对疑似病例做出正确的实验室诊断，对有效指导后续的疫情处理与防控工作具有极其重要的意义。

目前病毒疫苗株的鉴别检测方法主要为利用PT-PCR及Real-time RT-PCR的核酸检测方法，该方法需要特殊仪器，一些设备条件相对简陋的基层单位或检疫口岸无法进行。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP引物组，包括序列表中SEQ ID NO:2所示的引物F3、SEQ ID NO:3所示的引物B3、SEQ ID NO:4所示的引物FIP、SEQ ID NO:5所示的引物BIP、SEQ ID NO:6所示的引物LF和SEQ ID NO:7所示的引物LB。

本发明另一方面提供一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒，包含上述的RT-LAMP引物组。

上述RT-LAMP引物组在25μL反应体系中的使用浓度为：引物F3和B3的终浓度独立地为2～8pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为24～36pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为10～16pmol。

上述引物F3和B3的终浓度独立地为4pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为32pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为12pmol。

上述RT-LAMP试剂盒中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol Reaction Buffer、100mM MgSO₄、5mM betaine、10mM dNTP、8U Bst DNApolymerase和7.5U WarmStart RTx reverse transcriptase。