[发明专利]用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和应用

权利要求书

1.一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包含用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP引物组，其为序列表中SEQ ID NO:2所示的引物F3、SEQ ID NO:3所示的引物B3、SEQ ID NO:4所示的引物FIP、SEQ ID NO:5所示的引物BIP、SEQ ID NO:6所示的引物LF和SEQ ID NO:7所示的引物LB；

所述RT-LAMP引物组在25μL反应体系中的使用浓度为：引物F3和B3的终浓度独立地为2～8pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为24～36pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为10～16pmol；

所述RT-LAMP试剂盒中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×ThermopolReaction Buffer、100mM MgSO₄、5mM betaine、10mM dNTP、8U Bst DNA polymerase和7.5UWarmStart RTx reverse transcriptase；所述基础反应试剂在25μL反应体系中的使用量分别为：10×Thermopol Reaction Buffer 2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine4μl、10mM dNTP3.5μl，Bst DNA polymerase 1μl，WarmStart RTx reverse transcriptase0.5μl；

所述反应体系在进行恒温扩增反应时，控制反应温度为63℃-65℃。

2.根据权利要求1所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物F3和B3的终浓度独立地为4pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为32pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为12pmol。

3.根据权利要求1或2所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP试剂盒还包含阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包含黄热病毒疫苗株基因组RNA，所述阴性对照为不含黄热病毒疫苗株基因组RNA的反应体系。

4.一种采用权利要求1-3中任一项所述的RT-LAMP试剂盒检测黄热病毒疫苗株的非疾病诊断目的方法，包括以下步骤：

S1：提取待测样品RNA；

S2：反应体系配制：25μL反应体系包含2μL待测样品RNA、10×Thermopol ReactionBuffer2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，8U Bst DNApolymerase 1μl，7.5U WarmStart RTx reverse transcriptase 0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl，100μM LF/LB引物各0.3μl，100μM F3/B3所示引物各0.1μl，ddH₂O补至25μl；

S3：将反应体系置63℃-65℃条件下恒温扩增反应45-60min，获得反应液；

S4：结果分析：使用钙黄绿素颜色指示剂或浊度仪对所述反应液进行检测分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中将反应体系置65℃条件下恒温扩增反应50min。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤S4中所述结果分析的具体方法为：当使用钙黄绿素颜色指示剂进行检测时，在反应液中添加1μl的钙黄绿素颜色指示剂，呈现绿色表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株，为阳性，呈现橙色表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株，为阴性；

当使用浊度仪进行检测时，浊度上升(0.1)表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株，为阳性，浊度无变化表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株，为阴性。