[发明专利]一种用于检测金葡菌肠毒素sea、seb、sec基因的三重荧光定量PCR试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测肠毒素基因sea、seb、sec的荧光定量PCR试剂盒，包括引物和探针，其特征在于：所述的引物、探针序列如下所示：

第一上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，

第一下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，

第一探针的序列如SEQ ID No.3所示，

第二上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，

第二下游引物的序列如SEQ ID No.5所示，

第二探针的序列如SEQ ID No.6所示，

第三上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，

第三下游引物的序列如SEQ ID No.8所示，

第三探针的序列如SEQ ID No.9所示，

任意一个所述的探针的5’端标记有报告荧光基团，所述的探针的3’端标记有淬灭荧光基团。

2.根据就权利要求1所述的一种用于检测肠毒素基因sea、seb、sec的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：还包括Premix ExTaq、阳性质粒及灭菌水。

3.采用权利要求1或2所述的试剂盒检测肠毒素基因sea、seb、sec的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)先配制qPCR反应液，在每一个qPCR反应体系中，所述的qPCR反应液的体积为22μL，所述的qPCR反应液包括12.5μL 2×浓度的Premix ExTaq、1μL的第一上游引物、1μL第一下游引物、0.5μL第一探针、1μL第二上游引物、1μL第二下游引物、0.5μL第二探针、1μL第三上游引物、1μL第三下游引物、0.5μL第三探针、2μL灭菌双蒸水，任意一个引物和探针的浓度均为10μM；

2)按照检测样品数n，n＝待检样品数+2，取qPCR反应液于离心管中，置涡旋振荡器上振荡，每管分装22μL，盖上管盖备用；

3)将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA3μL加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光定量PCR仪中；

4)qPCR反应条件：42℃5min，95℃预变性10s，按以下参数循环40次：95℃2min，95℃15s，55℃20s；55℃时荧光检测，检测通道：FAM，VIC，Cy5；

5)结果判定：若Ct值＞35或无数值的标本为阴性；FAM、VIC、Cy5通道Ct值≤30的标本为阳性标本；30＜Ct值＜35的样本建议重做，重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。

4.根据权利要求2所述的检测肠毒素基因sea、seb、sec的方法，其特征在于：

检测方法的质控标准如下：

(1)阴性对照的Ct值应等于none；

(2)阳性对照的Ct值应≤30，否则，此实验视为无效；

(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。