[发明专利]一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法

说明书

本发明公开了一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法，本发明是能够在奶山羊卵母细胞体外成熟培养过程中，通过添加合适的和合适浓度的减数分裂抑制物，先抑制卵母细胞恢复减数分裂，延长卵母细胞处于生发泡期的时间，使卵母细胞有充分的时间完成胞质成熟，然后恢复减数分裂完成核成熟，从而达到了核成熟和胞质成熟的同步化，有利于IVM卵母细胞后续发育率的提高，通过选择最合适的CNP和雌激素浓度配比，以及减数分裂的抑制时间，使卵母细胞有充分的时间完成胞质成熟，然后恢复减数分裂完成核成熟，从而达到了核成熟和胞质成熟的同步化，进而提高IVM奶山羊卵母细胞后续发育率。

技术领域

本发明属于材料领域，涉及一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法。

背景技术

随着山羊体外受精、体细胞克隆和转基因等技术的发展，对山羊卵母细胞的需求日益增加。获得山羊卵母细胞的途径主要有两条，即体内冲取成熟卵母细胞和通过体外培养获得成熟卵母细胞。卵母细胞体外成熟是指从卵巢中分离未成熟卵母细胞，在体外经过适宜的条件进行培养，使卵母细胞发育成熟并具有受精能力。IVM技术不仅减少了激素使用量降低了成本，而且可提供数量较多的卵母细胞，是目前常用的获得山羊卵母细胞方法。卵母细胞的成熟包括核成熟和胞质成熟两个基本环节。卵母细胞只有细胞核和胞质二者都成熟后，才能支持正常的胚胎发育。在体内，卵泡液中的抑制因子控制卵母细胞不过早自发恢复减数分裂，而使卵母细胞经历一个相当长过程逐步获得胞质成熟。而在体外，由于脱离了卵泡液的抑制环境，卵母细胞提前自发恢复减数分裂，胞质没有充分的时间成熟，影响了后续发育能力，因此IVM获得的卵母细胞虽然数量多，但卵母细胞的后续发育率远不如体内成熟卵母细胞。为了改善IVM卵母细胞胞质成熟质量，一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法出现迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法，通过比较在山羊卵母细胞IVM体系中单独添加CNP或共同添加CNP和雌激素，通过对卵母细胞核成熟、胞质成熟和卵母细胞后续发育能力的分析，筛选CNP抑制山羊卵母细胞减数分裂以达到核质同步成熟并提高IVM卵母细胞质量的合适应用条件，不仅为利用CNP提高IVM山羊卵母细胞质量提供理论和实验基础，而且将以此为依托，建立一套新的高效的奶山羊卵母细胞体外成熟培养技术体系，为奶山羊胚胎工程的产业化提供更多的高质量的卵母细胞。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法，其特征在于，包括卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集、卵母细胞体外成熟培养以及卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养；

所述卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程具体如下：

1)自当地屠宰场采集卵巢；

2)将采集的卵巢放置在22℃～25℃的无菌生理盐水中，并在3h内运回实验室；

3)在含有0.1％PVA的mDPBS中收集卵丘-卵母细胞复合体；

4)将卵丘-卵母细胞复合体放置在实体显微镜下，通过实体显微镜收集有三层以上卵丘细胞且胞质均匀、形态良好的卵丘-卵母细胞复合体；

所述卵母细胞体外成熟培养过程具体如下：

1)将未成熟奶山羊卵母细胞放置在成熟培养液I中进行抑制培养抑制其减数分裂6小时；

2)将步骤一中的卵母细胞转入成熟培养液II中恢复减数分裂进行成熟培养18小时；

3)另取一组未成熟奶山羊卵母细胞，将该未成熟奶山羊卵母细胞放置在常规传统的成熟培养液中培养24小时；

4)统计未成熟卵母细胞在成熟培养液I中进行抑制培养的减数分裂抑制率以及成熟培养液II中培养的成熟率和后续发育率，将该数据与常规传统的成熟培养液进行对比，筛选出高效的奶山羊卵母细胞体外成熟培养液；

所述卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养：