[发明专利]一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法

权利要求书

1.一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法，其特征在于，包括卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集、卵母细胞体外成熟培养以及卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养；

所述卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程具体如下：

1)自当地屠宰场采集卵巢；

2)将采集的卵巢放置在22℃～25℃的无菌生理盐水中，并在3h内运回实验室；

3)在含有0.1％PVA的mDPBS中收集卵丘-卵母细胞复合体；

4)将卵丘-卵母细胞复合体放置在实体显微镜下，通过实体显微镜收集有三层以上卵丘细胞且胞质均匀、形态良好的卵丘-卵母细胞复合体；

所述卵母细胞体外成熟培养过程具体如下：

1)将未成熟奶山羊卵母细胞放置在成熟培养液I中进行抑制培养抑制其减数分裂6小时；其中，成熟培养液I成分包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液、适量100ng/ml的C型钠尿肽以及适量10nmol/L的β-雌二醇；

2)将步骤1）中的卵母细胞转入成熟培养液II中恢复减数分裂进行成熟培养18小时；其中，成熟培养液II成分包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、适量0.075U/mL的人绝经期促性腺激素、适量1μg/mL的β-雌二醇、适量10ng/mL的表皮细胞生长因子以及1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液；

3)另取一组未成熟奶山羊卵母细胞，将该未成熟奶山羊卵母细胞放置在常规传统的成熟培养液中培养24小时；

4)统计未成熟卵母细胞在成熟培养液I中进行抑制培养的减数分裂抑制率以及成熟培养液II中培养的成熟率和后续发育率，将该数据与常规传统的成熟培养液进行对比，筛选出高效的奶山羊卵母细胞体外成熟培养液；

所述卵母细胞孤雌激活和胚胎的培养：

1)将卵丘卵母细胞复合体移入0.1％(w/v)透明质酸酶中作用0.5min；

2)用适当口径吸管反复吹打，去除卵丘细胞；

3)选择能观察到第一极体的成熟卵母细胞；

4)将成熟卵母细胞在5μmol/Lionomycin中室温处理2min；

5)之后将步骤4）中的成熟卵母细胞放置于SOF培养液中进行洗净；

6)将洗净的成熟卵母细胞放置于含2mM6-DMAPSOF中，在38.5℃以及5％CO₂的条件下培养2h；

7)将步骤6）中的成熟卵母细胞放置在不含6-DMAP的SOF中，在38.5℃、5％CO₂以及饱和湿度条件下培养4h；

所述胚胎培养采用SOFaa培养液进行培养，其培养方法具体为：于四孔板的每个培养孔内加入500μL胚胎培养液并覆盖石蜡油，置于CO₂培养箱中预平衡，将孤雌激活胚胎随机移入到四孔板的培养孔中，置于38.5℃、5％CO₂以及饱和湿度的培养箱中培养，5d观察记录桑葚胚数，6～8d记录囊胚数。

2.根据权利要求1所述的一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法，其特征在于，卵巢收集和卵丘-卵母细胞复合体采集过程的步骤2）中的无菌生理盐水中添加有100IU/mL青霉素和0.05mg/mL硫酸链霉素。

3.根据权利要求1所述的一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法，其特征在于，卵母细胞体外成熟培养过程中的成熟培养液内每100μL成熟培养液培养25枚卵丘卵母细胞复合体，所述卵母细胞体外成熟培养具体在38.5℃以及5％CO₂环境下培养。

4.根据权利要求1所述的一种高效奶山羊卵母细胞体外培养方法，其特征在于，常规传统的成熟培养液的成分具体包括：89％组织培养基199制剂、10％胎牛血清、适量0.075U/mL的人绝经期促性腺激素、适量1μg/mL的β-雌二醇、适量10ng/mL的表皮细胞生长因子以及1％25-800-CR胰岛素-转铁蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸钠溶液。