[发明专利]一种针对个性化叶酸增补的基因分型快速检测方法及其引物组合、试剂盒

说明书

本发明公开了一种针对个性化叶酸增补的基因分型快速检测方法及其引物组合、试剂盒。该快速分型检测方法包括：基于四引物扩增阻滞突变系统(Tetra‑primers ARMS‑PCR)方法，对MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G等位基因位点进行识别与扩增。不仅可以使用基因组DNA进行检测，还可以直接以全血进行检测，免去DNA提取纯化的繁琐步骤。利用扩增片段标记的地高辛与纳米金磁微粒表面的地高辛单抗相互作用，结合侧向流层析技术，实现基因分型快速检测。利用金磁微粒作为载体，无需对PCR产物进行纯化、浓缩，可直接进行目视化判读结果。

技术领域

本申请涉及一种单核苷酸多态性(SNP)基因分型的快速试纸条检测方法，具体涉及针对叶酸个性化增补的MTHFR C677T、MTHFR A1298C及MTRR A66G基因多态性的快速分型检测方法。

背景技术

叶酸是一种水溶性B族维生素，参与体内核酸的合成和多种氨基酸的合成与代谢，还参与体内甲基化反应。若机体缺乏叶酸，会导致多种疾病产生，如心脑血管疾病、新生儿出生缺陷、癌症等。补充叶酸在脑卒中、神经管畸形的治疗过程中也起到了重要作用。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸代谢途径中的两个关键酶。当编码这两个酶的基因发生突变时，会引起叶酸代谢异常，引发疾病。目前已经报道的MTHFR基因多态性中，研究最多的MTHFR基因多态性是(1)C677T，即677核苷酸处的C→T碱基突变，产生丙氨酸到缬氨酸的转化；(2)A1298C，即1298核苷酸处的A→C碱基突变，导致蛋白质中丙氨酸转化为谷氨酸。而MTRR A66G基因多态性则影响了MTRR酶活性，会引起同型半胱甘酸水平升高。研究表明，这三个基因多态性与神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病、神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病，自发性流产等多种病症具有相关性，通过对基因多态性进行检测，可以预测疾病风险，并指导患者进行合理的个性化叶酸增补来预防疾病发生。

传统的酶切方法、DNA芯片杂交、质谱技术以及荧光定量PCR等方法，均已被用来检测SNP，但这些方法仍受限于昂贵的设备投入、复杂的操作和专业人员的培训，并不适合于大多数临床医院在常规临床检验中的推广使用，因此研究并开发用于快速基因分型的关键技术和相关检测产品有重大意义。

发明内容

本申请的目的是：实现针对个性化叶酸增补的基因分型快速试检测，以解决背景技术的方法操作复杂、检测时间长等问题、或需要价格昂贵的大型仪器设备等方面的限制。

为实现上述目的，本申请给出以下技术方案：

第一方面：特定引物组合在构建针对个性化叶酸增补的基因分型检测产品方面的用途，所述特定引物组合分为三组，分别针对MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G这三个SNP位点，对于每个位点均设计四条引物，包括两条外围引物与一条野生型特异性引物及一条突变型特异性引物进行识别与扩增：在两条外围引物的5’端均标记地高辛，野生型特异性引物5’端标记Cy5，突变型特异性引物5’端标记生物素；所述特定引物组合具体如下：

MTHFR C677T引物序列：

677(1)(Cy5)5’-GAGAAGGTGTCTGCGGGAGC-3’

677(2)(Dig)5’-CCTCACCTGGATGGGAAAGAT-3’

677(3)(Dig)5’-AGTCCCTGTGGTCTCTTCATCC-3’

677(4)(Bio)5’-GCTGCGTGATGATGAAATCTA-3’

MTHFR A1298C引物序列：

1298(1)(Cy5)5’-GGAGGAGCTGACCAGTGAAGA-3’