[发明专利]基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用有效

专利信息
申请号: 202010189509.0 申请日: 2020-03-18
公开(公告)号: CN111057783B 公开(公告)日: 2020-06-30
发明(设计)人: 赵丽丽;万康林;李马超;刘海灿 申请(专利权)人: 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
主分类号: C12Q1/689 分类号: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
代理公司: 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 代理人: 商秀玲
地址: 102206 *** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 基于 恒温 快速 扩增 技术 检测 结核 分枝杆菌 复合 rpob 突变 引物 探针 及其 应用
【说明书】:

发明涉及分子生物学及临床检测技术领域,具体涉及基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用。本发明以rpoB基因第1296位碱基突变作为分子标记鉴别结核分枝杆菌复合群菌株,针对该位点以及rpoB的516位点、526位点和531位点氨基酸突变设计了特异性引物探针组,开发了基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的方法。本发明的引物探针组检测灵敏度高、特异性强;该方法对设备的依赖性低,检测耗时短,可实现快速、准确的检测,结合侧向流动试纸条可实现可视化检测,对结核分枝杆菌复合群菌株的感染检测及结核分枝杆菌耐药性检测具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学及临床检测技术领域,具体涉及基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用。

背景技术

结核病主要是由结核分枝杆菌复合群菌株(Mycobacterium tuberculosisComplex,MTBC)所引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病,其中由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染导致的病例占绝大多数。结核分枝杆菌复合群主要包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌等多种亲缘关系相近的菌株;其中,除田鼠分枝杆菌已明确对人无致病力外,大多数结核分枝杆菌复合群菌株对人可致病;且产生大致相同的临床表现。非结核分枝杆菌(Non Tuberculosismycobacteria,NTM)是指除结核杆菌复合群菌株及麻风分枝杆菌以外的所有分枝杆菌。NTM感染症状与结核病症状类似、易造成误诊、漏诊,增加了结核病诊断和治疗的难度。因此,迅速、准确的检测、鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌感染已经成为影响临床用药与治疗效果的重要因素。

rpoB基因是编码细菌RNA聚合酶β亚单位的基因,该基因的突变直接导致其所编码的β亚单位构象异常,菌体与利福平类抗结核药物的亲和力降低,进而导致治疗失败。而利福平是一种广谱抗生素,对结核分枝杆菌有较强抗菌作用,被世界卫生组织推荐为治疗结核病的最主要药物之一。利福平与依赖DNA的RNA多聚酶β亚单位结合,抑制细菌RNA的合成,从而阻断RNA转录与延伸过程,使DNA和蛋白的合成停止、抑制细菌繁殖。结核分枝杆菌对利福平的敏感性是评价结核分枝杆菌耐药特征的重要指标,对利福平耐药的菌株大多对另外一种重要的抗结核药物异烟肼不敏感,对利福平和异烟肼同时耐药的菌株被称为耐多药(Multi-Drug Resistant Tuberculosis,MDR-TB)菌株或广泛耐药(Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)菌株。研究表明,超过95%的rpoB基因突变发生在81bp(编码507-533位点氨基酸)的核心区域—耐利福平决定区(Rifampicin ResistanceDetermining Region, RRDR);该区域内发生的突变与结核分枝杆菌对利福平类药物的敏感性变化密切相关。

目前用于检测结核分枝杆菌对利福平敏感性的方法主要有表型检测法(如传统药敏试验法和BACTEC MGIT 960法)和分子药敏法。其中,传统的在含抗结核药物的固体培养基上检测药物敏感性的方法,虽然简单、经济、适用于基层,但是培养时间长,通常需1-2月时间;通过BACTEC MGIT 960快速培养系统检测利福平敏感性的方法,虽然比较快速,但目前仪器设备严重依赖进口、且无论是设备本身还是配套试剂采购成本较高、设备的依赖性强。而分子生物学的发展推动了各种快速、准确、成本低廉的检测技术得以广泛应用。

多酶恒温快速扩增技术(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification,MIRA)是一种基于常温恒温核酸快速扩增的技术。具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点;反应组分可做冻干处理,操作简便,易于保存;无需购买价格高昂的专属设备;且可借助生物标记手段、与侧向流动检测技术相结合,在短时间内实现多重检测、以及短时间内检测结果的可视化读取。

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