[发明专利]一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法

说明书

一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，先向待检测外泌体蛋白样品加入SDT裂解液进行变性，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，置换完成后对变性样品进行溶液内酶解，最后提取酶解样品进行色谱‑串联质谱分析，具有快速、简单、高效、耐用性好和适合大规模自动化样品处理的特点。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法。

背景技术

外泌体是由细胞主动向外分泌的双层囊泡小体，可携带多种蛋白质、核酸和脂质等在体液中循环，具有物质“运输载体”的作用，能够将内含物质运输到周围细胞中进行细胞间的物质运输和信息交流，从而参与多种生理及病理学过程，如递呈抗原、促进肿瘤生长与迁移、修复损伤组织等。大量研究证实，外泌体对疾病治疗具有决定性帮助，特别是在疾病早期诊断和作为药物载体进行靶向治疗方面拥有广阔的应用前景，但使用传统的酶解方法进行分析，外泌体样品通常得率较低，样品比较珍贵。

常用的蛋白酶解方法有溶液内酶解和Filter-Aided Sample Preparation(简写为FASP)，其中溶液内酶切对蛋白溶液成分有限制，常见的变性剂(例如SDS，尿素，盐酸胍)均会影响胰蛋白酶活性从而影响酶解效果，而FASP酶解步骤繁琐，耗时长，样品损失大，不利于小量样本，因此新的酶解方法的发明对于外泌体蛋白的分析有着重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，先向待检测外泌体蛋白样品加入SDT裂解液进行变性，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，置换完成后对变性样品进行溶液内酶解，最后提取酶解样品进行色谱-串联质谱分析，具有快速、简单、高效、耐用性好和适合大规模自动化样品处理的特点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，先向待检测外泌体蛋白样品加入SDT裂解液进行变性，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，置换完成后对变性样品进行溶液内酶解，最后提取酶解样品进行色谱-串联质谱分析；包括如下详细步骤：

步骤S1样品变性，取外泌体蛋白样品加入SDT裂解液，再加入二硫苏糖醇(DTT)，混匀，在37℃的条件下孵育30-60min，加入碘乙酰胺(IAA)在黑暗条件下反应20-40min，再次加入二硫苏糖醇(DTT)至浓度恢复到和第一次加入时的浓度相等，室温放置10-15min，再加入等体积的SP3重悬液，混匀后震荡5-15min；所述的重悬液成分及各成分的终浓度为50mM4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，1％十二烷基硫酸钠(SDS),1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton100)，1％吐温20(Tween 20)，1％乙基苯基聚乙二醇(NP 40)，5mM乙二胺四乙酸(EDTA),50mM氯化钠(NaCl),1％(vol/vol)丙三醇(glycerol),1×蛋白酶抑制剂(cOmpleteprotease inhibitor),和5mM二硫苏糖醇(DTT)；

步骤S2置换裂解液，向步骤S1中获得的混合液中按质量比蛋白：磁珠＝1：10的比例加入磁珠混合液，同时加入无水乙醇浸没样品，将样品混匀反应，去除上清夜并用乙醇冲洗固体物；

步骤S3酶解，向步骤S2中获得的固体物加入NH₄HCO₃，再加入胰蛋白酶进行酶解，酶解后将上清液冷冻干燥，再加入FA溶液复溶，进行蛋白肽段定量分析；

步骤S4蛋白质组学分析，取步骤S3获得的肽段溶液进行蛋白质组学分析，包括高效液相色谱分离、串联质谱分析和对样品进行图谱比对分析。

根据以上方案，所述的步骤S1中的两次加入二硫苏糖醇的用量都是加入二硫苏糖醇至二硫苏糖醇的终浓度为10mM；碘乙酰胺的用量为添加碘乙酰胺至碘乙酰胺的终浓度为25mM；步骤S1中的混匀后震荡强度为800-1000rpm，震荡强度太小会影响反应效果，震荡太强使样品的损失加大。