[发明专利]一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法

权利要求书

1.一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，其特征在于，先向待检测外泌体蛋白样品加入SDT裂解液进行变性，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，置换完成后对变性样品进行溶液内酶解，最后提取酶解样品进行色谱-串联质谱分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，其特征在于，包括如下详细步骤：

步骤S1样品变性，取外泌体蛋白样品加入SDT裂解液，再加入二硫苏糖醇，混匀，在37℃的条件下孵育30-60min，加入碘乙酰胺在黑暗条件下反应20-40min，再次加入二硫苏糖醇至浓度恢复到和第一次加入时的浓度相等，室温放置10-15min，再加入等体积的SP3重悬液，混匀后震荡5-15min；所述的重悬液成分及各成分的终浓度为50mM 4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸，1％十二烷基硫酸钠,1％聚乙二醇辛基苯基醚，1％吐温20，1％乙基苯基聚乙二醇，5mM乙二胺四乙酸,50mM氯化钠,1％的丙三醇,1×蛋白酶抑制剂和5mM二硫苏糖醇。

步骤S2置换裂解液，向步骤S1中获得的混合液中按质量比蛋白：磁珠＝1：10的比例加入磁珠混合液，同时加入无水乙醇浸没样品，将样品混匀反应，去除上清夜并用乙醇冲洗固体物；

步骤S3酶解，向步骤S2中获得的固体物加入NH4HCO3，再加入胰蛋白酶进行酶解，酶解后将上清液冷冻干燥，再加入FA溶液复溶，进行蛋白肽段定量分析；

步骤S4蛋白质组学分析，取步骤S3获得的肽段溶液进行蛋白质组学分析，包括高效液相色谱分离、串联质谱分析和对样品进行图谱比对分析。

3.根据权利要求2所述的一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，其特征在于，所述的步骤S1中的两次加入二硫苏糖醇的用量都是加入二硫苏糖醇至二硫苏糖醇的终浓度为10mM；碘乙酰胺的用量为添加碘乙酰胺至碘乙酰胺的终浓度为25mM；步骤S1中的混匀后震荡强度为800-1000rpm。

4.根据权利要求2所述的一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中无水乙醇加入的量为添加无水乙醇至乙醇的终浓度为50％；步骤S2中的混匀反应的条件是900rpm摇晃混匀10min；所述的去除上清液并用乙醇冲洗固体物，具体是将磁珠和盛放容器放入磁力架吸附，吸取上清液，然后再加入180μl的80％乙醇，吹打混合，再放入磁力架吸附并吸取上清，再重复加入180μl的80％乙醇清洗2次。

5.根据权利要求2所述的一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中还包括步骤S31，在酶解过程中用MALDI检测蛋白酶解情况；所述的步骤S3中的NH4HCO3浓度为25mM，所述的胰蛋白酶的添加质量比例是样品蛋白：胰蛋白酶＝20-50：1，酶解条件为37℃恒温，1000rpm酶解12-24h；步骤S3中的FA溶液为0.1％FA溶液。

6.根据权利要求2所述的一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，其特征在于，所述的步骤S4中的高效液相色谱分离是取5μL步骤S3获得的肽段溶液进行高效液相色谱分离，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈浓度为84％，流速：250nl/min，液相梯度如下：液相分离梯度如下：0分钟—100分钟，B液线性梯度从0％到35％；100分钟—108分钟，B液线性梯度从35％到100％；108分钟—120分钟，B液维持在100％；所述的色谱分析柱为25cm*75μm，填料C18为1.9um，用95％的A相进行平衡。

7.根据权利要求2所述的一种基于SP3酶解的外泌体蛋白质分析方法，其特征在于，所述的步骤S4中的串联质谱分析条件是，采用正离子扫描模式，分析时长：120min，母离子扫描范围：300-1800m/z,一级质谱分辨率：60,000at m/z 200，最大增益控制：3e6，一级最大进样时间：25ms，扫描范围数目：1，动态排除时间：30.0s；

二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱(MS2 scan)，MS2解离模式：高能碰撞解离，隔离窗口：1.5m/z，二级质谱分辨率：15,000at m/z 200，Microscans：1，二级最大进样时间：15ms，碰撞能量：27eV，最小填充比：0.1％。