[发明专利]靶向RNA的6-甲基腺嘌呤修饰CasRx载体系统及制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种RNA编辑技术领域，尤指一种靶向RNA的6‑甲基腺嘌呤修饰CasRx载体系统及制备方法和应用，所述的载体系统包括失活的CasRx核酸酶融合6‑甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体、寡核苷酸，以及包括启动子序列、基于靶点序列的gRNA、gRNA支架序列和酶切位点序列的表达载体；本发明采用的载体系统可以对RNA修饰异常引起的疾病进行靶向修饰6‑甲基腺嘌呤，准确而高效，可以从根本上治疗RNA修饰缺陷引起的疾病。

技术领域

本发明涉及一种RNA编辑技术领域，尤指一种靶向RNA的6-甲基腺嘌呤修饰CasRx载体系统及制备方法和应用。

背景技术

腺嘌呤6-甲基化(即m⁶A)是mRNA和长链非编码RNA中最为常见的修饰，研究证实m⁶A修饰发生在细胞核内，由甲基转移酶METTL3、METTL14、结合亚基WTAP及RBM15(m⁶A‘Writer’，m⁶A编码器)和去甲基转移酶FTO、ALKBH5(m⁶A‘Eraser’，m⁶A消码器)动态催化调节。m⁶A可以通过结合YTH结构域蛋白(m⁶A‘Writer’，m⁶A读码器)发挥其生物学作用。

CDCP1是一种重要的跨膜蛋白，由836个氨基酸组成，包括一个含29个氨基酸残基的氨基端信号肤及分别由636、21、150个氨基酸组成的胞外段、跨膜段和胞内段。研究证实CDCP1作为Src、EGFR、HER2等信号通路的关键节点在多种肿瘤发生发展中起重要作用。我们前期研究发现促癌基因CDCP1的3'UTR存在m⁶A甲基化修饰。

近两年，靶向RNA的Cas13酶成为关注的热点，与RNA干扰类似，Cas13酶能够敲低RNA而不改变基因组，同时具有更高靶向特异性。最近，两个研究小组发现了一种新的Cas13d酶，它中位大小只有2.8kb，可以轻松包装到容量有限的载体中。为了鉴定Cas13d酶，Salk生物研究所和Arbor Biotechnologies公司的研究人员通过常用的生物信息学筛选，在推定的效应核酸酶附近寻找CRISPR重复序列。他们鉴定出的Cas13d蛋白与之前发现的Cas13a-c同源物的序列相似度不高，但含有Cas13超家族特有的HEPN核酸结构域。ArborBiotechnologies公司的Yan等人研究了来自惰性真杆菌的EsCas13d和瘤胃球菌属的RspCas13d，而Salk研究所的Konermann等人鉴定了来自厌氧消化宏基因组的AdmCas13d、黄色瘤胃球菌的CasRx以及EsCas13d。与其他Cas13酶一样，这些Cas13d同源物能独立地将CRISPR序列加工成向导RNA。它们依赖crRNA来切割目标，而不依赖HEPN结构域。这些酶对目标的侧翼序列没有要求，因此可以靶向任何RNA序列。Hsu团队意识到就像Cas9家族一样，源自不同细菌种类的Cas13d酶在它们的活性也会有所不同，因此他们进行筛选，以便鉴定出一种可在人细胞中使用的最佳Cas13d类型。他们发现这种最佳类型来自一种肠道细菌：黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)XPD3002，故命名为CasRx。Salk研究所的Konermann等人则发现，与核定位信号(NLS)融合的CasRx和AdmCas13d能够在哺乳动物细胞中很好地发挥功能。由于催化失活的dCasRx保留了RNA结合特性，Konermann等人分析了它选择性剪接RNA的能力。他们以编码痴呆相关tau蛋白的MAPT基因为研究对象，导入dCasRx以实现选择性剪接。通过AAV载体导入iPS衍生的皮质神经元之后，dCasRx介导选择性剪接，引起外显子跳跃，可迅速调整了致病性与非致病性tau蛋白的比例，展示了dCasRx的临床应用前景。与靶向RNA的其他技术相比，CasRx因具有较小的分子量(这使得很容易将它包装到治疗上相关的病毒载体中)和较高的效率而具有独特性，而且与RNA干扰相比，不产生明显的脱靶效应。

发明内容