[发明专利]一种抗生素耐药基因的定量检测方法

说明书

本发明提供一种抗生素耐药基因的定量检测方法，属于生物技术领域，包括以待测产品携带细菌总DNA为模板，分别采用引物对Ⅰ至引物对Ⅵ进行荧光定量PCR扩增，根据Ct值对待测产品中的tetA、sul2、cmlA、qnrS、aac(6')‑Ib、blaPSE抗生素耐药基因进行定量。该方法建立的目的基因标准曲线具有良好的线性关系，所有曲线都有较好的精确度和重复性，能用于计算待测样品中各基因的拷贝数，Ct取31为检出限，对blaPSE的最低检出限为6.6×10⁴copies/μL，对tetA、sul2、cmlA、qnrS、aac(6')‑Ib的最低检出限在24～202copies/μL之间。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗生素耐药基因的定量检测方法。

背景技术

我国是水产品生产和出口大国，在水产养殖中常常使用大量抗生素用于治疗疾病和促进生长。随着抗生素的滥用，细菌耐药性越发严重，抗生素耐药基因(AntibioticResistant Genes,ARGs)是耐药性产生的内在原因，ARGs能在细菌之间发生水平转移，有可能传播到人体内的致病菌中，给人类健康和生态安全带来潜在威胁。当前对水产品中ARGs研究多基于传统的分离培养方法研究细菌的耐药性或对其ARGs进行扩增，但该方法对自然界中大于95％的不可培养细菌无法实现分离，因此，单独使用该方法研究水产品中ARGs时只能揭示出小部分可培养微生物携带ARGs的信息，无法客观反映整体性评价水产品中微生物菌群ARGs污染状况。采用免培养的分子生物技术直接对水产品中细菌总DNA进行分析，能够更加客观地揭示水产中ARGs的含量和分布。从已有报道能明显看到我国水产品携带ARGs种类和数量相当繁杂，因此，急需建立多种ARGs定量检测的方法，才能更加有效地实现水产品中ARGs的检测分析。实时荧光定量PCR(qPCR)可实现PCR扩增和检测同步进行，PCR反应过程中即可同步检测荧光强度变化，能够在较短时间内实现同时对多个目的基因的定量检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗生素耐药基因的定量检测方法，该方法所用的引物设计较好，获得的6类抗生素耐药基因的标准曲线具有良好的线性关系、较好的精确度和重复性，能用于计算待测样品中各基因的拷贝数。Ct取31为检出限，建立的qPCR方法对blaPSE的最低检出限为6.6×10⁴copies/μL，对tetA、sul2、cmlA、qnrS、aac(6')-Ib的最低检出限在24～202copies/μL之间。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

提供一种引物组合甲，包括引物组合甲，包括引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ、引物对Ⅵ；

上述引物对Ⅰ由引物tetA-F和引物tetA-R组成，上述引物tetA-F的序列为SEQ IDNO.1，上述引物tetA-R的序列为SEQ ID NO.2；

上述引物对Ⅱ由引物sul2-F和引物sul2-R组成，上述引物sul2-F的序列为SEQ IDNO.3，上述引物sul2-R的序列为SEQ ID NO.4；

上述引物对Ⅲ由引物cmlA-F和引物cmlA-R组成，上述引物cmlA-F的序列为SEQ IDNO.5，上述引物cmlA-R的序列为SEQ ID NO.6；

上述引物对Ⅳ由引物qnrS-F和引物qnrS-R组成，上述引物qnrS-F的序列为SEQ IDNO.7，上述引物qnrS-R的序列为SEQ ID NO.8；

上述引物对Ⅴ由引物aac(6')-Ib-F和引物aac(6')-Ib-R组成，上述引物aac(6')-Ib-F的序列为SEQ ID NO.9，上述引物aac(6')-Ib-R的序列为SEQ ID NO.10；

上述引物对Ⅵ由引物blaPSE-F和引物blaPSE-R组成，上述引物blaPSE-F的序列为SEQ ID NO.11，上述引物blaPSE-R的序列为SEQ ID NO.12。