[发明专利]一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法

说明书

本发明提供了一种通过基因敲除提高5‑甲基四氢叶酸含量的方法。通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmGFT1实施基因敲除，发现该基因敲除后玉米中5‑甲基四氢叶酸含量得到显著提高。本发明中玉米ZmGFT1的CRISPR/Cas9靶标位点的设计以及该基因的功能能够显著影响叶酸含量的发现，不仅为该基因在玉米和其他作物中CRISPR研究提供了借鉴，还为玉米和其他作物的叶酸代谢提供了理论基础，通过提高转基因植物的叶酸含量，缓解人类在叶酸营养方面的隐形饥饿问题。

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法。

背景技术

在生物体中叶酸是一碳单位的供体和受体，参与嘌呤、甲酰甲硫氨酸-tRNA、胸苷酸、甘氨酸、丝氨酸和甲硫氨酸的生物合成，以及DNA和蛋白质的甲基化等功能。它属于水溶性的B族维生素，是四氢叶酸及其衍生物的统称，包括四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸等衍生形式。由于人类和其他动物不能自身合成叶酸，膳食摄取成为人类获取叶酸的主要来源。叶酸摄入不足会造成许多严重的健康问题，可以直接导致巨幼红细胞性贫血和高同型半胱氨酸原发性高血压，并增加患癌症、心血管疾病、老年痴呆症、冠状动脉硬化等多种疾病的风险。5-甲基四氢叶酸作为主要的叶酸活性形式之一，是人体血清中叶酸的主要存在形式，能够直接被人体吸收利用从而降低血液中同型半胱氨酸的水平，对于高血压和贫血等疾病都具有显著改善效果。目前一些国家和地区通常采用叶酸片补充等措施来改善叶酸缺乏的状况，但过量摄入人工合成叶酸会导致人体DNA甲基化水平和模式发生改变，加速结肠癌和前列腺癌的发展和癌前期病变的发生，还会掩盖维生素B12的缺乏。同时还有一部分人群中编码叶酸代谢基因亚甲基四氢叶酸还原酶的基因存在天然变异，使得他们难以将摄入的叶酸转化为具有活性的5-甲基四氢叶酸。这些都使得一些国家和地区叶酸缺乏的情况仍难以在短期内得以改善。由于植物中合成的叶酸主要是具有生物活性的叶酸形式，因此提高植物性膳食中的叶酸水平对改善我国人群叶酸缺乏状况与预防和减少相关慢性病的发生具有重要作用，对建设“健康中国”、实现我国经济和社会的可持续发展具有极其重要的现实意义。

基因组编辑技术是研究植物基因功能和农作物品种改良强有力的手段之一。其中，CRISPR/Cas9是一种用于靶标基因特定DNA修饰的工具，因其高效、便捷、适用范围广而成为当今最热门的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统主要由引导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白结构域组成，在识别、切割目标DNA双链后，通过同源重组或非同源末端连接修复途径产生DNA突变。该技术不仅可研究、鉴定和筛选与重要性状相关的基因，还能更准确快速地设计、改造作物品种，同时可有针对性地聚合多个优良性状，以提高植物的抗性、产量或品质。通过基因编辑的手段提高植物叶酸含量已成为目前生物强化的主要手段之一。

发明内容

本发明的目的是提供通过一种通过基因敲除提高5-甲基四氢叶酸含量的方法。

为了实现本发明目的，本发明利用基因编辑技术，对玉米中编码谷氨酸亚胺甲基转移酶1的基因ZmGFT1（该基因所在位点的编号为GRMZM2G124863，参考玉米基因组B72RefGen_v2）进行敲除突变，背景材料来源于自交系C01，扩增CDS序列引物对为Primer1(SEQID NO.5)/Primer2(SEQ ID NO.6)，其CDS序列为SEQ ID NO.1，编码的氨基酸序列为SEQ IDNO.2，具体优选的敲除突变靶位点为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

所述5-甲基四氢叶酸包括单谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸、二谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸、三谷氨酸尾5-甲基四氢叶酸。

所述的通过基因敲除提高玉米5-甲基四氢叶酸含量的方法步骤如下：