[发明专利]超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中8种儿茶酚胺及其代谢物的方法

权利要求书

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中8种儿茶酚胺及其代谢物的方法，

所述8种儿茶酚胺及其代谢物分别为：肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧酪胺、高香草酸和香草扁桃酸；

所述8种儿茶酚胺及其代谢物对应的内标物分别为：肾上腺素-d3、去甲肾上腺素-d6、多巴胺-d4、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3、3-甲氧酪胺-d4、高香草酸-d3和香草扁桃酸-d3；

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的尿液中的上述8种儿茶酚胺及其代谢物，先利用超高效液相色谱将待测物与尿液基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述8种儿茶酚胺及其代谢物的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：0.05％～1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；

色谱柱型号：Agilent Pursuit PFP 2.0×150mm，3.0μm；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至60:40；在1.5-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至2:98；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1；

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为0.5kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为150℃；雾化气温度为600℃，雾化气流速为1000L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述色谱柱为五氟苯基柱；所述流动相A为0.05％～0.5％甲酸水溶液；流速为0.2～1.0mL/min；柱温为30～50℃；进样体积为0.5～2μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述流动相A为0.1％甲酸水溶液；所述流速为0.4mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为1μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿液为人或动物的尿液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述经过预处理的尿液按照如下方法制备：取过滤后的尿液于离心管中，向其中加入混合内标工作液，涡旋后取上清液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述经过预处理的尿液按照如下方法制备：取20μL过滤后的尿液于1.5mL离心管中，向其中加入780μL混合内标工作液，涡旋后取70μL上清液。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，

所述混合内标工作液按照如下方法制备：去甲肾上腺素-d6和变肾上腺素-d3以溶液形式购入，浓度均为100μg/mL；以30％～70％甲醇水溶液将肾上腺素-d3、多巴胺-d4、去甲变肾上腺素-d3、3-甲氧酪胺-d4、高香草酸-d3和香草扁桃酸-d3配制成浓度分别为2mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、1mg/mL、10mg/mL的同位素内标溶液；再以30％～70％甲醇水溶液将肾上腺素-d3、去甲肾上腺素-d6、多巴胺-d4、变肾上腺素-d3、去甲变肾上腺素-d3、3-甲氧酪胺-d4、高香草酸-d3和香草扁桃酸-d3的浓度分别稀释至2μg/mL、8μg/mL、40μg/mL、4μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、800μg/mL、200μg/mL；再将上述内标液各取20μL加入到0.24mL稀释液中，得混合内标液；最后取混合内标液200μL，加入1mL萃取液，再以78.8mL超纯水稀释，得混合内标工作液。