[发明专利]一种大豆快生根瘤菌SMH12的突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种大豆快生根瘤菌SMH12的突变体及其应用，利用CreloxP系统双交换置换方法，构建nopP基因缺失突变体。以快生型根瘤菌SMH12基因组DNA为模板，采用nopP‑up‑F/R和nopP‑down‑F/R引物对，分别扩增nopP同源交换上臂和下臂，将产物双酶切后分两步与消化的pCM351载体连接，得到质粒转化即可获得突变体。从而构建获得根瘤菌目标基因突变体。该nopP基因突变或缺失后，豆科植物的防御反应被抑制或解除，从而促进根根瘤菌侵染和固氮。改良后的根瘤菌可提高豆科作物的生长和固氮能力，减少农业生产中的氮肥施用，将产生巨大经济和生态效益。

技术领域

本发明属于农用微生物菌剂技术领域，具体涉及一种大豆快生根瘤菌SMH12的突变体及其应用。

背景技术

影响根瘤菌剂效能发挥的因素很多，主要包括宿主豆科植物、根瘤菌、环境三方面。从菌植互作的角度来看，豆科植物-根瘤菌的共生固氮与宿主植物品种的差异性有关。不同豆科植物分泌的类黄酮种类、结构不同；不同豆科植物的遗传和基因型也不同，这些均影响接种根瘤菌剂的应用效果。这种现象也称为根瘤菌-豆科植物的共生匹配性。同一根瘤菌在不同大豆品种上，或不同根瘤菌在同一大豆品种上的结瘤、固氮特性差别很大。只有根瘤菌-豆科植物匹配性好的组合，才能更好发挥根瘤菌接种剂的固氮效应。

如果能够筛选或者通过基因改良手段获得具有广谱匹配性能的根瘤菌，则更易于推广使用。我国是大豆的起源国，土壤中土著根瘤菌丰富，这些根瘤菌竞争力强，但大多无效或低效。另外，近十年来，我国大豆品种已经更新，然而根瘤菌株更新速度相对滞后。因而导致现有的接种根瘤菌与主栽的大豆品种匹配性差。同时，有些基因型的大豆品种表现出对根瘤菌剂的结瘤限制现象。研究报道调控根瘤菌结瘤能力的因素包括结瘤因子、胞外多糖等。细菌产生效应蛋白的方式和种类很多，其中三型分泌系统(T3SS)产生的效应蛋白在病原菌-宿主相互作用中的研究较多。根瘤菌三型分泌系统(T3SS)分泌的NopP蛋白在根瘤菌家族中是特有的，在病原菌中不存在同源基因。NopP蛋白在快生型根瘤菌、中生型根瘤菌中的功能是未知的。结合申请人的最新研究结果，申请人合理推断宿主豆科植物通过感知特定的根瘤菌T3SS效应蛋白NopP，并通过防御反应来抑制根瘤菌侵染。

经过检索，基于特定效应蛋白的突变或敲除提高豆科作物结瘤、固氮能力的根瘤菌接种剂却无报道。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种基于根瘤菌特定效应蛋白基因的缺失来构建突变体，抑制(阻止)豆科植物的免疫防御反应，从而扩大和提高豆科植物的共生结瘤固氮能力。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种大豆快生根瘤菌SMH12的突变体，所述的突变体通过以下步骤构建得到：

1)以大豆快生根瘤菌SMH12的基因组DNA为模板，分别扩增nopP同源交换上臂和下臂；

2)将产物双酶切后分两步与消化的pCM351载体连接，得到质粒pCM351::nopP-up-down；

3)将质粒pCM351::nopP-up-down导入大豆快生型根瘤菌SMH12中转化，获得突变体。

进一步的，步骤(1)中扩增引物为nopP-up-F/R和nopP-down-F/R，

其中：

nopP-up-F：GGTACCATCATCTGGCAATCGGTT；

nopP-up-R：CATATGACGAGCTATCAATTCGACC；

nopP-down-F：GGGCCCGACTTACGAAGATGACTTCATG；

nopP-down-R：ACCGGTCATCTACTTATGAGCTCCAGC。