[发明专利]基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用。本发明中的引物组及方法的检测特异性高、重复性好、灵敏度高，同时具有操作简便，检测时间短等优势，可有效地降低假阳性结果的出现，降低阳性对照对检测环境的影响，在非洲猪瘟病毒的快速检测中具有较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种烈性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类疫，我国将其列为一类动物疫病。ASF不传染人，感染猪后病死率可达100％。ASFV感染猪后，其临床症状和病理。

变化与经典猪瘟非常相似，极易将两种病混淆。主要表现为高热(猪体温一般高达40.5～42℃)，皮肤发绀有出血点，甚至出现大量无症状死亡的猪只，其中脾脏异常肿大为其典型症状。猪是ASFV自然感染的唯一家畜，野猪也易感，野猪感染后的临床症状和病理变化与家猪类似。钝缘蜱是ASFV的自然宿主。被ASFV污染的猪肉制品(如火腿、腌肉、风干肉等)、饲料、水源、运输车、餐食剩余垃圾等制成的泔水，发病猪，带毒猪等都是ASFV的传染源。

目前，全世界尚未有有效的药物和疫苗可以防控ASF的感染。对于尚无该疫情的地区，要加强防控，建立ASF监测体系，完善ASF净化措施，将ASF疫情隔离在外。一旦发现ASF疫情，要尽快隔离病猪，扑杀患病猪群，销毁死亡猪只，对运输猪只的来往车辆、接触病猪的相关人员以及圈舍都要进行严格的消毒处理，对废弃物及时采取无害化处理措施；同时，对患病区周围的猪群尽快采用病原学检测等方法进行疫情监测。ASF病原学检测方法主要包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、红细胞吸附试验(hemadsorption，HAD)、荧光抗体试验(flurescent antibody test，FAT)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。

ASFV对养猪业的发展有很大不利，为了更好地防控非洲猪瘟的发生与流行，各种非洲猪瘟病原的快速检测技术及产品不断出现，随着检测频率的不断增大，加上检测人员技术水平参差不齐、检测环境的差异，导致一些假阳性检测结果的出现。

B646L(p72)是国内外学者公认的应用于非洲猪瘟病毒检测方法的研究中保守性最好的基因，因此针对p72基因建立了多种抗原检测方法，其中以普通PCR和real-time PCR方法居多，这也是临床上检测ASF病原最常用的两种快速检测方法。比如，CN109593893A中提到了基于ASFV的p72基因设计的引物和检测方法，但就非洲猪瘟病毒防控而言，抗体检测要滞后于抗原检测，不能有效地对非洲猪瘟病毒进行早发现、早处置。

另外，在崔贝贝等发表的文章中报道有通过非洲猪瘟病毒E184L和K196R基因建立的单基因检测方法，在CN110423761A中提到了编码ASFV的p54蛋白的基因以及基于该蛋白基因设计的ASFV非洲猪瘟病毒的抗体检测方法。

单基因检测方法相对于双基因检测，在一定程度上会出现假阴性或者假性的结果，通过双基因的相互验证可有效地降低这种现象发生，避免不必要的经济损失。在CN110373500A中提到了一种基于B646L(p72)和B438L(p49)双基因的双重荧光PCR检测ASFV的试剂盒及其应用，但其缺陷在于，相较于单基因检测，该方案会一定程度上降低检测的敏感性。此外，该技术方案中的阳性对照为B646L(p72)和B438L基因串联质粒载体，如长期使用并不能有效降低检测方法出现假阳性的概率；同时，该发明所涉及的加样体系，操作繁琐，单孔体系加样需要加入0.1μL的体积，模板加样量为1uL，加样6次，对操作人员有一定的要求，检测试剂也会造成不必要的浪费。

发明内容