[发明专利]基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用

权利要求书

1.基于B646L和E183L双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物探针组合，其特征在于，所述PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

2.根据权利要求1所述的PCR引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

3.权利要求1或2所述的PCR引物探针组合在制备用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒中的应用。

4.一种用于检测非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的PCR引物组探针组合。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含PCR反应液和/或对照品。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述对照品为含有特定DNA片段的质粒，所述特定DNA片段的核苷酸序列中含有检测B64L6基因的上游引物、探针的核苷酸序列及检测E183L基因的下游引物翻转、互补后的核苷酸序列；或者，含有检测E183L基因的上游引物、探针的核苷酸序列及检测B64L6基因的下游引物翻转、互补后的核苷酸序列。

7.一种非诊断目的的非洲猪瘟病毒的双基因实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：提取待测样品中的病毒DNA，以所述病毒DNA为模板，利用权利要求1或2所述的PCR引物探针组合，或者利用权利要求4～6中任一项所述的检测试剂盒，进行双基因实时荧光定量PCR，根据扩增曲线和/或Ct值判断检测结果。

8.根据权利要求7所述的非诊断目的的非洲猪瘟病毒的双基因实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述双基因实时荧光定量PCR的反应程序如下：95℃、30s；95℃、5s，60℃、20s，采集荧光信号，35个循环。

9.根据权利要求7或8所述的非诊断目的的非洲猪瘟病毒的双基因实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述双基因实时荧光定量PCR的待测样品的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，待测样品DNA 7μL；

阳性对照的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品7μL；

阴性对照的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液或者E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品8.5μL；

其中，所述B646L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.1所示的引物、10μM SEQID NO.2所示的引物和5μM SEQ ID NO.5所示的探针；所述E183L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.3所示的引物、10μM SEQ ID NO.4所示的引物和5μM SEQ ID NO.6所示的探针；所述PCR反应液包含DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物；所述反应缓冲液中含有80-100mM KCl、pH 8.5的15-20mM Tris-HCl、4-5mM MgCl₂；所述dNTP混合物含有dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.4-0.8mM。