[发明专利]一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法

说明书

本发明公开了一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其通过过表达甲酸脱氢酶提高菌株对纤维素水解液中乙酸和甲酸的耐受能力。在本发明提供的方法中，可在纤维素乙醇生产菌株中，过表达甲酸脱氢酶，提高菌株对纤维素水解液中甲酸和乙酸的抗性，方法简单可行，降低物料脱毒成本，有助于纤维素乙醇的产业化生产。

技术领域

本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，具体地，其是一种通过过表达甲酸脱氢酶同时提高微生物对甲酸和乙酸耐受能力的方法。

背景技术

纤维素原料来源广泛、价格低廉，有效转化纤维素原料还有利于农村经济，被广泛研究为生产生物燃料和生物基化学品。木质纤维素原料需要进行预处理过程来获得微生物可直接利用的糖类，但是预处理之后会产生多种抑制物对细胞生长代谢有毒害作用，影响后续的发酵，抑制物主要包括：弱酸(甲酸和乙酸等)、呋喃类(糠醛和5-羟甲基糠醛等)、酚类化合物(香草醛和4-水杨酸等)，预处理的方法不同，水解液中的抑制物含量也有所不同。

乙酸是纤维素水解液中含量最高的抑制物之一，浓度为1.0g/L～15.0g/L[Wei N,Enhanced biofuel production through coupled acetic acid and xyloseconsumption by engineered yeast[J].Nature Communication,2013,4:2580-2587.]，其通过释放H⁺导致细胞内环境酸化，为了保持胞内环境稳定，细胞通过消耗ATP将乙酸排到胞外，造成能量损失致使细胞活性下降。乙酸的存在还会引起微生物细胞的氧化应激反应，产生大量ROS，引起细胞损伤。

甲酸在纤维素水解液中的浓度较低为1.4g/L左右，但是对酵母的毒性较乙酸强，甲酸pKa＝3.75小于乙酸的pKa＝4.75，且甲酸的分子更小更易于扩散，所以具有更强的毒性。由于胞内的pH较高，未解离的甲酸可以从培养基中扩散到整个质膜表面，从而降低胞质pH，影响细胞活性[Oshoma CE，Screening of Non-Saccharomyces cerevisiae Strainsfor Tolerance to Formic Acid in BioethanolFermentation[J].PLoS One,2015，10(8),e0135626.]。所以提高微生物发酵菌株对纤维素水解液中主要抑制物(甲酸和乙酸)的耐受能力，对以纤维素水解液为底物生产的生物乙醇、生物油脂及其他生物基化学品，具有重要意义。

甲酸脱氢酶是通过催化甲酸的氧化产生二氧化碳，并产生还原性NADH和ATP，其是已知的，广泛的应用在腐胺的生成(专利申请号201780017515.4)、辅酶的还原(专利申请号201711230338.6)等反应中，但是对提高乙酸的胁迫能力方面，目前并无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够同时提高微生物菌株对甲酸和乙酸耐受能力的方法。

本发明的技术方案为：

为了实现上述目的，在一方面，本发明提供一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其包括在微生物发酵菌株中过表达甲酸脱氢酶的步骤。

在一个具体的实施方案中，甲酸脱氢酶来源于不同的微生物发酵菌株；例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、毕赤酵母(Pichia pastoris)。