[发明专利]一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法

权利要求书

1.一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

制备免疫磁珠：使用偶联方法将磁小体与SPA偶联，制得免疫磁珠；

连接免疫磁珠和相应的抗体：将所述SPA的Bdomain与抗体非可变区FC端结合，制得结合抗体的免疫磁珠；

富集：将生物医学及环境标本与连接相应的抗体的磁珠混合，富集与抗体对应的抗原。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SPA为SPA重组蛋白，所述SPA重组蛋白的序列如下：

GGATCC CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKG

SGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAGCTT。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述SPA重组蛋白是在对来自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的SPA基因的结构进行改造的基础上进行的，所述重组蛋白的合成方法包括以下步骤：

(a)在天然SPA基因的B domain的N端添加一个半胱氨酸引入巯基；

(b)在引入巯基的SPA基因的两端分别添加BamHⅠ与HindⅢ酶切位点；

(c)将步骤(b)的SPA基因克隆进入PET28(a+)载体，并转化进入E·coli BL21内；

(d)用IPTG进行诱导表达；

(e)用亲和层析柱进行分离纯化得到纯净蛋白，即得重组蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制备所述免疫磁珠时使用的偶联剂为3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠的构建方法是将磁小体膜的氨基与重组蛋白SPA中的巯基进行偶联，所述构建方法包括以下步骤：

A.将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯用DMSO溶解，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO中的浓度为5-15mg/mL，再加入PBS进行稀释，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO和PBS总体积中的浓度为0.5-1.5mg/mL，制得SPDP溶液；

B.取磁小体与所述SPDP溶液混合后置于EP管中，所述磁小体在所述SPDP溶液中的浓度为0.5-1.5mg/mL，超声波超声30次，超声1min，间歇1min；

C.用PBS(PH＝7.4)洗掉剩余的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，然后加入1mg/mL的重组蛋白0.8-1.5mL，按照步骤B中操作方法进行偶联；

D.用PBS清洗偶联后的磁小体5-10次，即得免疫磁珠。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，连接免疫磁珠和相应的抗体的方法包括以下步骤：

Ⅰ.取免疫磁珠加入抗体中使免疫磁珠在抗体中的浓度为0.5-1.5mg/mL，超声波混匀，制得混合液；

Ⅱ.将所述混合液放置于摇床中在37℃、200rpm的条件下混合1.5-2.5h；

Ⅲ.将步骤B制得的混合物置于磁力架上磁力吸附0.5-1.5min,用PBS清洗5-10次，即得。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，富集的方法包括以下步骤：

S1:在待收集的样本中加入免疫磁珠，制得免疫磁珠-样本混合物；

S2:用超声混合器将免疫磁珠-样本混合物进行超声，超声时间不少于1min；

S3:再将免疫磁珠-样本混合物置于37℃，200rpm条件下混合，混合时间不少于30min；

S4:用磁力架对免疫磁珠-样本混合物进行磁力吸附后弃上清，用PBS(PH＝7.4)清洗三遍，即得磁珠-抗原混合物。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测，所述检测的方法是直接加入辣根过氧化物酶标记的二抗或碱性磷酸没标记的二抗进行免疫检测。