[发明专利]一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法

说明书

本申请属于病毒蛋白检测技术领域，具体涉及一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法。本发明提供了一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法，包括以下步骤：1)将体外表达的病毒蛋白样本溶于盐酸中，震荡混匀；2)超声处理；3)向超声后的样品中加入与步骤1)等体积的盐酸，震荡混匀；4)孵育；5)将孵育后的样品超声，然后在12000‑15000rpm离心5‑10分钟；6)取上清液置于超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行检测；7)将检测结果与数据库进行比对得蛋白鉴定结果。本方法通过胃蛋白酶和buffer搭配，达到了灭活和酶解的效果。通过蛋白质水平进行病毒鉴定，样本量极其少，避免大量培养和繁殖细胞，极大降低了病毒感染给科研人员的风险，而且节约了培养细胞的时间和成本。

技术领域

本申请属于病毒蛋白检测技术领域，具体涉及一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法。

背景技术

通过质谱对生物系统中蛋白进行定性定量，已经成为一种主流的分析工具。基于质谱的蛋白组研究通常依赖于蛋白被消化成肽段，然后进行后续的定性定量分析。因此蛋白的酶解对于后续质谱实验至关重要，也是最耗时的一个实验。质谱的结果与样本类型，裂解条件，酶解消化和分馏方法等等密切相关。实验室最常见的溶液酶切手段是FASP(filter-aidedsample preparation)，当然还有最传统的In-solution(溶液内)酶切的方法。每一种酶切方法各有优劣，in-solution法比较费时，成本相对小，但是鉴定蛋白数目少且重复性较差。FASP方法虽然十分高效，但是实验步骤较多，需要较长时间，并且还需要承担过滤的费用成本，且不同的裂解配方(SDS和8M尿素)所鉴定的蛋白不同。最后，这两种方法都是针对大量蛋白，利用胰蛋白酶的酶解的方法。而针对微量蛋白的酶解和质谱鉴定，目前没有一个比较快速且高效的方法。

针对目前对微量蛋白样品，特别是病毒量级的蛋白样品的检测和鉴定，没有一个比较完善的方法，兼顾样品本身的生物学特性和质量、体积极微量的特点。FASP和in-solution的酶解只适用于大量蛋白的酶解，且花费时间较长。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法，包括以下步骤：1)将体外表达的病毒蛋白样本溶于盐酸中，震荡混匀；2)超声处理；3)向超声后的样品中加入与步骤1)等体积的盐酸，震荡混匀；4)孵育；5)将孵育后的样品超声，然后在12000-15000rpm离心5-10分钟；6)取上清液置于超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行检测；7)将检测结果与数据库进行比对得蛋白鉴定结果，其中，所述步骤1)中，盐酸中含0.01-0.03mg/mL胃蛋白酶。

作为一种优选的技术方案，步骤1)中病毒蛋白样本与盐酸的比例为1：(190-210)pg/μL。

作为一种优选的技术方案，所述盐酸的浓度为18-22mM。

作为一种优选的技术方案，步骤2)中超声2-4次，每次8-12秒。

作为一种优选的技术方案，步骤2)中超声3次，每次10秒。

作为一种优选的技术方案，所述步骤3)中的盐酸浓度和步骤1)中相同。

作为一种优选的技术方案，在37℃培养箱或金属浴孵育1小时。

作为一种优选的技术方案，步骤5)中将孵育后的样品超声8-12s，然后在12000-15000rpm离心5-10分钟。

作为一种优选的技术方案，在14000rpm离心5-10分钟。

作为一种优选的技术方案，步骤6)中取上清液置于10kd超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行LC-MS/MS检测。