[发明专利]一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法及VIGS沉默系统

说明书

本发明提供了一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法，采用VIGS沉默系统转染香蕉果实，VIGS沉默系统包括烟草脆裂病毒pTRV1和含有SEQ ID NO.1所示序列的烟草脆裂病毒pTRV2。本发明首次实现了香蕉果实淀粉降解相关基因VIGS沉默系统的构建，能够有效沉默香蕉果实淀粉降解相关基因。本发明还进一步明确了菌液浓度、辅助病毒载体和表达病毒载体的比例、培养温度、侵染时间等条件，为成功沉默基因掌控好每个技术环节，有效抑制香蕉果实总淀粉和直链淀粉含量降低以及果糖、葡萄糖、蔗糖等含量升高。本发明为香蕉果实淀粉降解相关基因的功能验证奠定了良好的基础，为控制香蕉或其他植物果实淀粉降解提供了研究思路和技术依据。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法及VIGS沉默系统。

背景技术

香蕉是热带、亚热带地区重要的经济作物，是仅次于柑橘的世界第二大水果。淀粉作为香蕉果实中的主要组成成分，又促使其被联合国粮农组织(FAO)认定为仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物，是超过4亿人的口粮(Englberger et al.,2006)。然而，随着香蕉产业的快速发展和人们生活水平的迅速提高，对香蕉果实品质的要求也越来越高。然而香蕉主栽品种多为三倍体，难以通过传统育种方式获得品质优良的新品种。当无性繁殖的香蕉栽培种缺少有利的自然变异时，转基因就成为了外源基因导入香蕉实现品质改良的有效手段。可是由于香蕉这种作物的特殊性以及香蕉遗传转化的难度，在香蕉中鉴定品质相关基因的功能并获得品质改良的香蕉果实需要3-5年甚至更长的时间。随着生物技术的快速发展，将现代生物技术运用于香蕉品质改良中，可以解决一些用常规方法难以解决的问题。

病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)属于转录后的基因沉默，是植物体内存在的一种防御病毒入侵的自然机制。它指携带植物功能基因cDNA片段的重组病毒，在侵染植物体后诱导植物发生基因沉默而出现表型突变，可以通过植物表型或生理指标上的变化来快速反映该基因的功能。VIGS是20世纪90年代新兴的一种技术，发展迅速，已广泛应用于生物学诸多领域的研究。病毒诱导的基因已经在多种果蔬上应用，如温小红以‘澳洲青萍’果实为材料，探究了乙烯转录因子对果实的成熟衰老的影响沉默基因并且对沉默后果肉呈现的表型变化进行了解释；宋恬利用基因沉默的方法对扁桃的花器官进行了沉默，以及对其表型进行初步分析，探索了低温条件下对花药发育器官的调控；洪敏利用VIGS干扰枇杷果实中PSY基因的表达，探究了PSY基因在枇杷果实类胡萝卜素积累过程中的调控作用；台德强以观赏海裳变色叶品种‘紅花’为试验材料，建立VIGS体系，测定并分析花色菩等类黄酌物质含量及花色普相关基因表达量，并优化了在组培苗、幼果中沉默环境条件；戴文珊利用病毒介导的基因沉默技术获得了FcWRKY40金柑沉默材料并且阐述了此基因在植物盐胁迫抗性中起正调控作用；此外，VIGS这一技术也在葡萄、樱桃有应用。与传统的基因功能验证手段相比，病毒诱导的基因沉默具有时间短，速度快，高通量，不需要依赖于稳定的遗传转化，并且提供了沉默一个基因家族单个或者多个基因的潜力等优势。但未在香蕉中得到应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种基于VIGS沉默系统抑制香蕉果实淀粉降解的方法及VIGS沉默系统，能够有效沉默香蕉果实淀粉降解相关基因，可有效抑制香蕉果实淀粉的降解，抑制香蕉果实中果糖、葡萄糖、蔗糖等产生。

本发明的第一个方面是提供一种抑制香蕉果实淀粉降解的方法，采用VIGS沉默系统转染香蕉果实，其中，所述VIGS沉默系统包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为烟草脆裂病毒pTRV1，所述表达病毒载体为含有目的基因DNA片段的烟草脆裂病毒pTRV2，所述目的基因DNA片段如序列表中SEQ ID NO.1所示序列。

优选地，所述VIGS沉默系统中辅助病毒载体和表达病毒载体的比例为1:(1-3)，更优选为1:(2-3)。

优选地，所述方法包括以下步骤：