[发明专利]一种基于表面等离子共振技术的抗体生物活性检测方法

说明书

本发明提供一种基于表面等离子共振技术的抗体生物活性检测方法，具体涉及生物检测技术领域，选用LAG3受体高表达的人Burkitt's淋巴瘤细胞株Daudi细胞与C1芯片结合，固定于芯片表面；当LAG3与芯片表面细胞结合，通过生物大分子相互作用仪Biacore T200捕捉响应信号；当加入抗LAG3抗体时，LAG3与细胞结合减少，响应值降低，通过比较响应值实现细胞水平的抗体活性进而实现快速检测。本发明不仅步骤简单，易操作，可实时动态监测，效率高，且具有特异性识别作用，且在免疫检查点靶点的抗体药物筛选、批次放行、稳定性监测、甚至工艺开发等应用中都具有很大优势。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于表面等离子共振技术的抗体生物活性检测方法。

背景技术

免疫检查点阻断抗体可通过增强免疫系统功能来与癌症作战，近年来这种癌症免疫疗法正成为治疗各类恶性肿瘤的重要方法之一。免疫检查点可以是刺激性或抑制性的，共刺激蛋白会传导信号促进对病原体的免疫反应，抑制性则相反。其中抑制性分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和程序性细胞死亡受体1(PD-1)是目前研究的最多两个免疫检查点分子。CTLA-4是第一个用于临床的免疫检查点靶点，其抑制剂ipilimumab在2011年批准上市。程序性死亡受体-1(PD-1)与其配体PD-L1，作为治疗恶性肿瘤的新靶点也有巨大潜力。起初在转移性黑色素瘤展现惊人结果后，又陆续在肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌等有了新的突破。今后多靶点联合用药将会给癌症治疗带来更好的疗效，更多靶点的产品将陆续上市。

生物活性作为抗体药物的关键质量属性之一，在药物筛选、批次放行、稳定性监测、甚至工艺开发过程中都需要检测。目前抗体药物的活性分析方法主要是体外(invitro)检测,基于细胞的分析方法由于其具有操作简便,周期短,特异性好,变异度小等优点得到广泛应用。然而，现有的检测方法都不能满足靶向免疫检查点抗体的体外活性快速检测需求，例如，混合淋巴细胞反应法(Mixed lymphocyte reaction,MLR)和抗原特异性刺激检测法(antigen-specific recall assays)可以通过检测IFN-γ的分泌来检测生物活性，但检测周期较长，需要4-5天。且这些方法使用的是原代细胞，由于来源于不同个体带来的差异性以及实验操作的复杂性，使得这两个检测方法的变异性很大。另外，基于T细胞增殖、细胞毒性等的体外活性检测方法，同样由于需要使用原代细胞以及复杂的操作，并不满足作为免疫检查点抗体的生物活性快速检测方法。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种步骤简单，易操作，可实时动态监测，效率高，具有特异性识别作用的抗体生物活性快速检测方法。

本发明提供了如下的技术方案：

一种基于表面等离子共振技术的抗体生物活性检测方法，其步骤如下：选用LAG3受体高表达的人Burkitt's淋巴瘤细胞株Daudi细胞与C1芯片结合，固定于芯片表面；当LAG3与芯片表面细胞结合，通过生物大分子相互作用仪Biacore T200可以很直接捕捉到响应信号；当加入抗LAG3抗体时，LAG3与细胞结合减少，响应值降低，通过比较响应值实现细胞水平的抗体活性快速检测；

优选的，仪器温度设置为25℃，芯片C1芯片，上样速度为10μl/min，结合时间为10s，芯片再生条件为以pH1.5浓度为10mmol/L的盐酸甘氨酸溶液以30μl/min的流速再生30s。

优选的，先以人LAG3胞外区蛋白的cDNA为模板，PCR扩增LAG3胞外区蛋白的基因片段，克隆至表达载体pTT5上，实现LAG3胞外区蛋白重组表达质粒的构建；

再将上述构建得到的人LAG3胞外区蛋白重组载体转染至HEK293细胞中进行蛋白瞬时表达。收集表达后的细胞上清，用镍离子亲和柱(GE公司产品)及分子排阻层析柱Superdex 200(GE公司产品)进行分离纯化，得到的人LAG3胞外区蛋白用于后续的检测方法分析；