[发明专利]一种新的质粒载体构建方法

说明书

本发明公开了一种新的质粒载体构建方法。本发明首先公开了利用CRISPR/Cpf1或CRISPR/Cas9构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法；进一步公开了包括crRNA和Cpf1蛋白或gRNA和Cas9蛋白的成套试剂。本发明利用crRNA和Cpf1蛋白或gRNA和Cas9蛋白替代限制性内切酶对载体进行线性化，得到线性化载体；运用PCR方法得到两端含同源臂的插入片段，该两端同源臂分别与所述线性化载体两端序列同源；运用同源重组克隆的方法将插入片段重组到线性化载体上，最终构建得到新的载体，整个构建过程中未使用任何限制性内切酶及连接酶，构建方法方便、灵活、通用、简单、高效。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种新的质粒载体构建方法，特别涉及采用CRISPR系统构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法。

背景技术

限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。二型限制性内切酶由于其识别和切割位点相重叠或相邻近，其识别位点常被加入到质粒载体中，形成多克隆位点MCS，因此在构建载体时，限制性内切酶常被用在各种质粒载体的线性化和载体构建中。几乎所有载体的构建都要用到限制性内切酶。限制性内切酶的使用方便了质粒载体的构建过程，但是受限于其识别位点的种类，无法实现质粒载体的随意改造，并且插入序列后会存在识别序列残留，无法实现无缝插入。

现有最常用的质粒载体构建方法有两种，一种为酶切连接方法，即限制性内切酶酶切载体和插入片段，再利用T4 DNA连接酶进行连接，然后转化，抗性筛选和鉴定得到阳性克隆；另一种为同源重组克隆方法，即利用限制性内切酶酶切载体，同时在插入片段的PCR产物两侧引入载体上酶切位点两侧的同源序列，然后利用重组酶实现载体片段与插入片段间的体外重组，通过转化(有缺口的重组克隆会在大肠杆菌内得到修复)，抗性筛选和鉴定得到阳性克隆。但是以上两种方法都受限于限制性内切酶和其识别位点，使质粒载体构建仅能在限制性内切酶识别位点处进行，且改造后质粒载体保留有多余的限制性内切酶识别序列。

CRISPR系统在2013年最早被运用到哺乳动物基因编辑中，其依靠一种引导RNA来引导Cas或其他种类的DNA切割蛋白，引导RNA可识别特定的DNA序列并引起其双链断裂。不同的引导RNA可识别不同靶点，在哺乳动物基因组实现特异性识别和断裂，完成基因编辑。

但是迄今为止，鲜有关于利用CRISPR系统进行载体构建的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为找到一种能替代限制性内切酶的方法以实现含有外源DNA分子的无缝重组载体的构建。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了利用CRISPR/Cpf1或CRISPR/Cas9构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法。

本发明方法为CRISPR/Cpf1法或CRISPR/Cas9法；

所述CRISPR/Cpf1法包括如下步骤：

1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cpf1蛋白识别的PAM序列的载体(克隆载体或表达载体)，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM；

2)以所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列为靶点序列制备CRISPR RNA(crRNA)；

3)利用所述crRNA与Cpf1蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体

4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法得到含有外源目的DNA分子的重组载体；