[发明专利]一种新的质粒载体构建方法

权利要求书

1.构建含有外源目的DNA分子的重组载体的方法，其特征在于：所述方法为CRISPR/Cpf1法或CRISPR/Cas9法；

其中，所述CRISPR/Cpf1法包括如下步骤：

1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cpf1蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM；

2)以所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列为靶点序列制备crRNA；

3)利用所述crRNA与Cpf1蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；

4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有外源目的DNA分子的重组载体；

所述CRISPR/Cas9法包括如下步骤：

1)获取骨架载体，所述骨架载体为含有Cas9蛋白识别的PAM序列的载体，所述Cas9蛋白识别的PAM序列命名为Cas9-PAM；

2)以所述骨架载体中所述Cas9-PAM的上游DNA序列为靶点序列制备gRNA；

3)利用所述gRNA与Cas9蛋白对骨架载体进行切割，得到线性化载体；

4)将外源目的DNA分子两端分别加上与所述线性化载体两端分别同源的同源臂后，再与所述线性化载体通过同源重组克隆法进行连接得到含有外源目的DNA分子的重组载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cpf1-PAM的下游DNA序列的长度为17-30bp；所述Cas9-PAM的上游DNA序列的长度为17-30bp。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Cpf1-PAM为5′-YTN-3′；所述Cas9-PAM为5′-NGG-3′；其中，Y代表T或C，N代表A，T，G或C。

4.一种成套试剂，其特征在于：所述成套试剂为试剂A或试剂B；

其中，所述试剂A包括crRNA和Cpf1蛋白；

所述试剂B包括gRNA和Cas9蛋白。

5.根据权利要求4所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂中所述试剂A还包括骨架载体A，所述骨架载体A上含有Cpf1蛋白的PAM序列，所述Cpf1蛋白识别的PAM序列命名为Cpf1-PAM，所述crRNA与所述骨架载体中所述Cpf1-PAM的下游DNA序列特异性结合；

所述成套试剂中所述试剂B还包括骨架载体B，所述骨架载体B上含有Cas9蛋白的PAM序列，所述Cas9蛋白识别的PAM序列命名为Cas9-PAM，所述gRNA与所述骨架载体中所述Cas9-PAM的上游DNA序列特异性结合。

6.根据权利要求4或5所述的成套试剂，其特征在于：所述Cpf1-PAM为5′-YTN-3′；所述Cas9-PAM为5′-NGG-3′；其中，Y代表T或C，N代表A，T，G或C。

7.权利要求4-6任一所述的成套试剂在构建含有外源目的DNA分子的重组载体中的应用。