[发明专利]鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽及其制备方法、含半胱氨酸肽-锌螯合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将鳜鱼蛋白配置浓度为12-20%鳜鱼蛋白液，倒入发酵罐中，按3%-8%接种量分别接种清酒乳杆菌和腐生葡萄球菌，所述腐生葡萄球菌的保藏编号为GDMCC 60709，发酵温度设为20-40℃，发酵时间为3-7d，获得鳜鱼蛋白发酵液；

S2，将步骤S1中的鳜鱼蛋白发酵液进行灭菌和过滤，取滤液，将所述滤液放置于-18℃冷冻24h，再于4-10℃解冻24h，解冻液进行离心，去除沉淀，取上层清液，将所述上层清液旋转蒸发，浓缩后，冷冻干燥，获得鳜鱼蛋白肽粗粉；

S3，将步骤S2中的鳜鱼蛋白肽粗粉进行亲和柱层析，获得鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽，所述亲和柱层析的方法如下：将亲和填料与锌离子结合，生成琼脂糖-锌填料，之后装柱；所述亲和填料为Chelating sepharose fast flow、IMAC sepharose high performance、Ni-IDA QZT 6FF或Ni-NTA QZT 6FF；所述亲和柱层析采用检测波长为220nm；平衡液为pH7.4的水溶液；洗脱液为pH3.5的水溶液，将所述鳜鱼蛋白肽粗粉溶于pH7.4的水溶液，浓度为40-100mg/mL，上样量为柱体积的2-3%，采用平衡液洗3个柱体积，去除未螯和的肽，再采用洗脱液洗脱，收集洗脱液，即为所述鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽。

2.根据权利要求1所述的鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述灭菌的温度为121℃，所述灭菌的时间为30min；所述过滤采用2层滤纸或8层纱布；所述离心的转速为3000-5000转/分钟，所述离心的时间为10-20min。

3.如权利要求1或2所述的制备方法获得的鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽。

4.含半胱氨酸肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将碱性蛋白酶、胰酶、氨肽酶和羧肽酶，进行混合，制成混合酶，将所述混合酶添加至植物油料蛋白中，所述碱性蛋白酶、所述胰酶、所述氨肽酶和所述羧肽酶的酶活比为20:4:1:2或15:15:1:1，所述植物油料蛋白为大豆油料蛋白、花生油料蛋白和菜籽油料蛋白，所述大豆油料蛋白、所述花生油料蛋白和所述菜籽油料蛋白分别按1:1-1:10的比例加入水，并且调节pH值至8.0-9.0，形成大豆油料蛋白液、花生油料蛋白液和菜籽油料蛋白液，向三种植物油料蛋白液中分别按照蛋白活性与底物比10:1-100:1（u/g）加入所述混合酶，进行酶解反应，所述酶解反应的温度为45-65℃，所述酶解反应的时间为12-24h；所述酶解反应结束后，灭酶得到酶解液，再将酶解液离心去除残渣，获得的上清液经干燥制得大豆油料蛋白粗品粉末、花生油料蛋白粗品粉末和菜籽油料蛋白肽粗品粉末；所述大豆油料蛋白粗品粉末、所述花生油料蛋白粗品粉末和所述菜籽油料蛋白肽粗品粉末分别进行亲和柱层析，获得植物油料源的含半胱氨酸肽；

所述亲和柱层析的方法如下：将亲和填料与锌离子结合，生成琼脂糖-锌填料，之后装柱，获得亲和柱，所述亲和填料为Chelating sepharose fast flow、IMAC sepharose highperformance、 Ni-IDA QZT 6FF或Ni-NTA QZT 6FF；采用检测波长为220nm；平衡液为pH7.4的水溶液；洗脱液为pH3.5的水溶液，将所述大豆油料蛋白粗品粉末、所述花生油料蛋白粗品粉末和所述菜籽油料蛋白肽粗品粉末分别溶于pH7.4的水溶液，浓度为40-100mg/mL，上样量为柱体积的2-3%，采用平衡液洗3个柱体积，去除未螯和的肽，再采用洗脱液洗脱，收集洗脱液，即为植物油料源的含半胱氨酸肽，所述植物油料源的含半胱氨酸肽包括大豆源含半胱氨酸肽、花生源含半胱氨酸肽和菜籽源含半胱氨酸肽，所述植物油料源的含半胱氨酸肽中大豆源含半胱氨酸肽、花生源含半胱氨酸肽和菜籽源含半胱氨酸肽的比例为1:1:2；

（2）将权利要求3所述的鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽与步骤（1）中的植物油料源的含半胱氨酸肽分别与ZnSO₄•7H₂O或ZnCl₂进行螯和反应之后，经过浓缩冷冻干燥，分别获得鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽-锌粉末和植物油料源的含半胱氨酸肽-锌粉末，所述螯和反应中肽与锌盐的比例为1:1-1:5，所述螯和反应的温度为10-55℃，所述螯和反应的时间为15-120min，所述螯和反应的pH为5-8；

（3）将步骤（2）中的鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽-锌粉末和植物油料源的含半胱氨酸肽-锌粉末进行混合，获得含半胱氨酸肽-锌螯合物，所述鳜鱼蛋白源的含半胱氨酸肽-锌粉末和植物油料源的含半胱氨酸肽-锌粉末的混合比例为1:10-10:1。