[发明专利]一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法

说明书

本发明涉及一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法，所述方法是将含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体经缓冲液悬浮，制成菌悬液；向菌悬液中添加改性硅藻土，搅拌混匀，加入聚乙烯亚胺，然后再加入戊二醛进行交联，15～35℃搅拌交联0.5～5h后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后，粉碎成粒，得到含葡萄糖异构酶的固定化葡萄糖异构酶制剂；本发明所提供的固定化方法具有固定化材料成本低，操作简单，机械强度高，制备的固定化产葡萄糖异构酶重组大肠杆菌全细胞用于催化D‑葡萄糖生产D‑果糖，在60℃条件下，分批次反应重复使用40批次后，仍具有86％以上的残余酶活力；连续反应603h，时空产率为3.8kg/L/d，平均转化率大于42％，具有良好的工业化应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法。

(二)背景技术

葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，GI)，又称木糖异构酶，能将D-葡糖转化成甜度比蔗糖更高的D-果糖，是工业上利用生物转化法生产果葡糖浆(High Fructose CornSyrup，HFCS)的关键酶。HFCS是一种以玉米淀粉为原料，经液化、糖化、连续异构化加工成的D-葡萄糖和D-果糖组成的混合糖糖浆。果葡糖浆作为天然的甜味剂，具有溶解度高、化学和热稳定性好、渗透压大、吸潮性和保湿性强、与其它添加剂混合不影响食品风味等优势，广泛应用于食品、软饮料、医药等行业。

葡萄糖异构酶在适宜的反应条件下，可以表现出较高的异构化性能，但在工业生产中游离酶的活性大幅度降低、稳定性差、不可重复使用、分离困难，大大降低游离酶在实际生产中的应用。为了克服上述游离酶在实际生产中的弊端，可将其固定化，固定化酶(细胞)是通过物理、化学的方法把酶细胞固定成具有高活力、水不溶性、颗粒状的固定化制剂，以实现生产的连续化、自动化、低成本化。

硅藻土的化学成分主要为二氧化硅，作为一种稳定、廉价的天然吸附剂，因其表面具有大量排列有序的孔隙，比表面积较大等物理特性而广泛应用于污水处理，空气净化，生物催化剂的固定化等领域。硅藻土表面具有羟基官能团，其在吸附过程中起到主要吸附作用。为进一步增加硅藻土的吸附性能和稳定性，我们对硅藻土进行改性，通过对其后进行酸洗精制、氧化剂氧化和扩孔等改性处理后，一方面能增加硅藻土表面的含氧基团，提高其亲水性能，另一方面增大硅藻土比表面积和孔容比，提高吸附量。硅藻土经改性后就是增加了其表面官能团的数量或者改变其化学键从而大大增加其吸附能力。

近年来，随着人们对HFCS需求的日益增长促进了HFCS产业的蓬勃发展，每年世界上生产的HFCS就有千万吨，对固定化葡萄糖异构酶制剂的需求很大，而我国的固定化葡萄糖异构酶制剂市场一直被国外公司垄断，造成果葡糖浆的生产成本过高。因此，研究一种成本低、性能优异且可实现工业化生产的固定化方法具有非常重要的现实意义。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有技术的不足，提供一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法，所述方法包括：

(1)硅藻土改性：取适量天然硅藻土加入到2～3倍体积的5～6M的盐酸溶液中，充分反应(去除一些金属氧化物杂质)后去离子水洗涤至中性，重新悬浮于H₂SO₄浓度60～80％(w/w)、HNO₃浓度10～20％(w/w)的混合酸中，40～50℃超声处理2～3h(增加硅藻土表面的含氧量)，冷却至室温，抽滤后用去离子水洗涤至中性，得到氧化后的硅藻土加水搅拌制浆，置于马福炉中于500～600℃下焙烧2～3h，然后过滤、干燥、过筛制得到改性硅藻土，干燥储存备用；