[发明专利]一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法

权利要求书

1.一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法，所述方法包括：

（1）硅藻土改性：取适量天然硅藻土加入到2倍体积的6 M的盐酸溶液中，充分反应后用去离子水洗涤至中性，重新悬浮于H₂SO₄浓度为72%、HNO₃浓度为17%的混合酸中，40 ℃超声处理3 h，冷却至室温，抽滤后用去离子水洗涤至中性，得到氧化后的硅藻土，在氧化后的硅藻土中加水搅拌制浆，置于马福炉中于500 ℃下焙烧3 h，然后过滤、干燥、过筛制得改性硅藻土，干燥储存备用；所述硅藻土的质量与混合酸的体积之比为1g：6mL；

（2） 异构酶固定化：将含有葡萄糖异构酶的湿菌体用磷酸盐缓冲液悬浮，获得菌悬液；向菌悬液中加入改性硅藻土，在室温、650 rpm条件下水浴搅拌30 min；再加入质量浓度5%的聚乙烯亚胺水溶液，在室温、650 rpm条件下水浴搅拌交联1 h；然后加入质量浓度10%的戊二醛水溶液，在室温、650 rpm条件下水浴搅拌交联1 h，抽滤，滤饼用磷酸盐缓冲液清洗1~2次，粉碎，即获得葡萄糖异构酶固定化细胞；所述改性硅藻土与湿菌体质量之比为0.1~0.2:1；聚乙烯亚胺水溶液用量为0.3~0.7 mL/g湿菌体；戊二醛水溶液用量为0.1~2.0 mL/g湿菌体；

所述含有葡萄糖异构酶的湿菌体，是以SEQ ID NO.1所示葡萄糖异构酶基因构建基因工程菌，再经活化培养、种子培养和发酵培养，于发酵液中获得；

所述基因工程菌的构建方法如下：将SEQ ID NO.1所示葡萄糖异构酶基因与PGEM-T载体连接后导入E.coli JM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切后，连接过夜，将连接产物导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI，即所述基因工程菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述湿菌体由如下方法获得：

（1）将所述基因工程菌接种至含有50 μg/mL卡那霉素的斜面培养基，37 ℃培养12 h，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成如下：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，5 g/L酵母粉，20g/L琼脂粉，溶剂为去离子水；

（2）将斜面菌体接种至含有50 μg/mL卡那霉素的种子培养基，37 ℃，150 rpm培养10h，获得种子液；所述种子培养基组成如下：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，5 g/L酵母粉，溶剂为去离子水；

（3）将种子液以体积浓度1 %接种量接种至发酵培养基，37 ℃、150 rpm条件下培养至OD₆₀₀ 达到0.6~0.8，然后加入终浓度0.1 mM IPTG，28℃，150 rpm条件下诱导11 h，取发酵液离心，收集获得湿菌体；所述发酵培养基组成如下：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，5 g/L酵母粉，溶剂为去离子水。