[发明专利]添加在饲料中木聚糖酶的测定方法

说明书

发明涉及饲料领域，具体涉及添加在饲料中木聚糖酶的测定方法。该方法将待测饲料样品预冷经乙酸缓冲液透析，然后测定酶活。本发明所述添加在饲料中木聚糖酶的微量测定方法通过饲料样品的预处理，避免了木聚糖酶在提取过程中失活，降低了木聚糖酶检测下限，消除了干扰背景的影响，因此能够准确测定添加在饲料中木聚糖酶含量。

技术领域

本发明涉及饲料领域，具体涉及添加在饲料中木聚糖酶的测定方法。

背景技术

2009年发布了饲用木聚糖酶活性测定方法的国家标准GB/T 23874-2009。1个木聚糖酶活性单位定义为：在37℃和pH为5.5的条件下每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中释放出1μmol还原糖所需要的木聚糖酶的数量。

现有测定方法(GB/T23874-2009)中，“DNS法”测定木聚糖酶含量的原理为：木聚糖酶在一定温度和pH条件下，水解木聚糖，生成寡糖和单糖，还原性的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应，在波长540nm下进行比色测定。具体过程为：取待反应液(酶浓度约0.04U/mL～0.10U/mL)2.0mL，37℃水浴预热10分钟，加入已预热至37℃的木聚糖溶液2mL，37℃精确水解30分钟，加入5mLDNS试剂，沸水浴加热5分钟，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL。以标准曲线的空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，根据实测吸光值计算木聚糖酶的活性。该方法适用于作饲料添加剂用的木聚糖酶产品，不适用于添加有木聚糖酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料，样品最低检出量为10U/g。

但是，用于测定添加在饲料中的木聚糖酶时，饲料中的木聚糖酶酶活约为1.0U/g饲料，远远低于该方法的检测下限。并且，该方法直接测定配合饲料中的木聚糖酶活性，空白对照组与反应组吸光度OD540超过1.5，远远超出了方法的测定最高值，而且二者无明显差异。

目前木聚糖酶大多是从细菌或真菌中得到，大量的木聚糖酶分离纯化后性质鉴定表明，不同来源的木聚糖酶在分子量、等电点、最适温度和pH值上都有着明显的不同，并且在对底物的选择性上也有区别。

用GB/T23874-2009测定不同来源的木聚糖酶，检测结果变异系数较大，无法准确测定，因此，需要有一种快速、简便，具有高度特异性、灵敏度、准确度的方法，测定木聚糖酶的活性以及添加在饲料中的木聚糖酶的活性，将会更有利于科学合理地制作配方，促进木聚糖酶产业的发展。

发明内容

为了解决上述问题，提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种添加在饲料中木聚糖酶的测定方法。

根据本发明的添加在饲料中木聚糖酶的测定方法包括以下步骤：

(1)制备试样溶液，将待测饲料样品预冷至4℃，粉碎过筛，充分混匀后准确称取样品加入乙酸缓冲液，待测饲料样品与乙酸缓冲液的质量体积比1:10，在4℃环境下搅拌，过滤，弃去初滤液，取过滤液移入透析袋进行透析，

其中，所述透析的条件为：置于4℃预冷的透析外液乙酸缓冲液中，透析外液体积为透析样液的10倍，透析时间为20小时，透析10小时需换一次透析外液，透析后准确量取体积；

(2)测定酶活，取透析液，37℃水浴预热10分钟，加入已预热至37℃的等体积木聚糖溶液，37℃水解30分钟，加入5mL DNS试剂，沸水浴加热5分钟，冷却至室温，加水定容，

以标注木聚糖酶标准曲线的标准空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，用直线回归方程计算木聚糖酶的活性，根据实测吸光值通过以下公式计算待测饲料样品中的木聚糖酶的活性

式中，C为根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，F为试样溶液反应前的总稀释倍数，m为试样重量。