[发明专利]一种适用于枯草芽孢杆菌的非天然氨基酸利用工具

说明书

本发明公开了一种适用于枯草芽孢杆菌的非天然氨基酸利用工具，属于基因工程领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主，通过在胞内表达特定tRNA和相应的特异性识别非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶，使枯草芽孢杆菌能够利用非天然氨基酸翻译终止密码子TAG。同时，通过调节非天然氨基酸浓度，使枯草芽孢杆菌内形成了一个严密的蛋白表达开关，达到定向调控基因表达强度或蛋白表达量的效果。本发明为枯草芽孢杆菌表达带有非天然氨基酸的高活性酶，降低工程菌逃逸概率等方面的应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种适用于枯草芽孢杆菌的非天然氨基酸利用工具，属于酶工程领域和基因工程领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为革兰氏阳性菌的模型微生物，用于孢子形成机制和代谢调节的实验室研究，在自然界广泛分布，包括土壤表面，水环境和动物胃。它是一种非致病微生物，不含内毒素，并且通常被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全(GRAS)食品级微生物。此外，枯草芽孢杆菌具有许多优点，包括：细胞生长快，培养时间短，培养要求低，分泌蛋白质能力强，广泛用于工业酶生产，高附加值产品的生物合成。然而，对于其非天然氨基酸的应用研究仍然落后于其他重要的模式生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

非天然的氨基酸目前在多个重要领域都具有广泛的应用，如提高酶活、合成非天然蛋白，作为蛋白表达开关等，然而以往的研究大多在大肠杆菌中进行，对于实现枯草芽孢杆菌对于非天然氨基酸的利用，目前尚未有相关研究。非天然氨基酸系统在构建严密的蛋白开关，控制蛋白表达量，工程生物防逃逸等方面有着巨大的应用潜力，因此，为了给酶工程、代谢工程等领域的发展打下基础，在枯草芽孢杆菌中开发有效的非天然氨基酸利用系统是亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于枯草芽孢杆菌的非天然氨基酸利用工具，是将非天然氨基酸利用相关基因引入枯草芽孢杆菌后，使其能够利用特定的非天然氨基酸来编码终止密码子TAG，达到调控基因表达强度或蛋白表达量的目的。

本发明的第一个目的是提供一种基于非天然氨基酸调控的表达载体，含有编码tRNA的序列和特异性识别非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶基因。

在一种实施方式中，所述氨酰tRNA合成酶序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，编码所述氨酰tRNA合成酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述tRNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述表达载体含有一个或多个编码tRNA的序列。

在一种实施方式中，所述表达载体含有P₄₃启动子与3个拷贝的tRNA。

在一种实施方式中，所述表达载体含有SEQ ID NO.4所示的序列。

本发明的第二个目的是提供一种表达系统，含有所述基于非天然氨基酸调控的表达载体及表达目的基因的载体或宿主细胞。

在一种实施方式中，所述宿主细胞在基因组上整合目的基因，并在目的基因ATG之后第三位密码子处插入终止密码子TAG。

在一种实施方式中，所述表达目的基因的载体是将目的基因连接在质粒上，并在目的基因ATG之后第三位密码子处插入终止密码子TAG。

本发明的第三个目的是提供含有所述表达载体的基于非天然氨基酸调控的细胞。

在一种实施方式中，所述细胞是细菌或真菌细胞。

在一种实施方式中，所述细胞是重组枯草芽孢杆菌。