[发明专利]云杉花墨天牛特异性引物及快速分子检测方法

说明书

本发明公开了属于生物的分子检测领域的云杉花墨天牛特异性引物及其快速检测的方法。该方法提取天牛样本的基因组DNA，运用PCR的方法，经琼脂糖凝胶电泳显像，即可实现对云杉花墨天牛快速准确地鉴定。本发明完成整个鉴定仅需2‑3小时，与DNA条形码试剂盒检测技术相比，具有检测时间短，不需要第三方公司测序的优点。该发明能在不受虫态和地理种群的限制下完成鉴定工作，尤其针对卵、低龄幼虫和蛹。本发明可用于对木质包装材料、疫木、电缆盘、光缆盘中云杉花墨天牛的快速准确鉴定，防止媒介昆虫被人为传播到其他地区，能有效控制松材线虫的进一步传播和扩散。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及云杉花墨天牛特异性引物，以及利用该引物对云杉花墨天牛进行快速检测的方法。

背景技术

松材线虫病是由松材线虫寄生松树引起的具有毁灭性的检疫性森林病害。中国是目前遭受松材线虫病威胁最严重的国家，发生面积大，扩散速度快，我国所有松树树种都是松材线虫的潜在寄主；致病力强且寄主死亡速度快，松科树种感病后最快40d左右死亡，感病后若不采取有效措施，只需3-5年即可造成整片松林死亡，造成损失巨大，自松材线虫入侵我国的30年来，已致死数十亿株松树。松材线虫自身无法转移，其自然扩散需要借助媒介昆虫的自然活动，携带线虫的媒介昆虫还可以借助人为运输实现远距离的人为扩散。墨天牛属(Monochamus)昆虫是松树的蛀干害虫，同时，也是松材线虫最主要的传播媒介。目前，已知能携带松材线虫的昆虫全球共有46种，其中能作为松材线虫传播媒介的昆虫共13种，均为墨天牛属的昆虫，其中云杉花墨天牛已成为我国东北地区松材线虫的主要媒介昆虫，红松、樟子松、长白落叶松、日本落叶松和华北落叶松在我国已被证实为松材线虫的自然感病寄主。

目前，云杉花墨天牛的鉴定主要依据成虫的形态特征，与同域分布的同属天牛(如云杉大墨天牛、云杉小墨天牛、樟子松墨天牛等)的形态特征十分相似，在其形态学鉴定工作中，需要专业的昆虫分类学知识；同时，处于卵、低龄幼虫、蛹三个虫态下，云杉花墨天牛与其他天牛科昆虫的形态亦极其相似；并且，不同地理种群的云杉花墨天牛的形态特征也存在差异，无法准确进行种类鉴定。因此，在不受虫态和地理因素的限制下，如何实现对云杉花墨天牛快速准确地鉴定，已成为亟待解决的问题。

近些年，分子生物学的快速发展已为昆虫快速准确地鉴定提供了强有力的技术支撑。线粒体DNA严格母系遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(CO I)具有高度保守，结构稳定，无内含子且种间变异大的特点。因此，CO I基因常作为昆虫DNA条形码用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究。在墨天牛属昆虫鉴定，Koutroumpa等用线粒体基因中的CO I基因和28S基因研究了欧洲樟子松墨天牛(Monochamus galloprovincialis)和云杉小墨天牛(M.sutor)间的关系；安榆林等运用RAPD技术分析了松墨天牛、云杉大墨天牛、和云杉小墨天牛的DNA多态性，可对三种天牛幼虫进行准确鉴定；陈梦义等运用DNA条形码试剂盒(DNAbarcoding identification kit technology)检测技术，对墨天牛属8个种的CO I基因进行扩增，获得了云杉花墨天牛的标记性碱基位点(Specific bases)，以此作为鉴定云杉花墨天牛的依据。然而，上述方法均需要第三方公司参与测序，耗费时间较长，无法快速鉴定云杉花墨天牛。

发明内容

本发明的主要目的在于利用分子生物学手段，在短时间内快速、准确地对我国松材线虫的媒介昆虫——云杉花墨天牛，在不受虫态和地理种群的限制下完成鉴定工作，尤其针对除成虫和老熟幼虫以外其它虫态(卵、低龄幼虫和蛹)的鉴定工作。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测云杉花墨天牛引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，即5’-CTTTAATTGGAGATGACCAAATTTAT-3’，其下游引物核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，即5’-GTTTATACCACTAGGTCGTATATTAATAACG-3’。

该引物对是采用PCR技术，经过大量的筛选实验得到，利用PCR扩增，可获得云杉花墨天牛的特异性DNA片段。