[发明专利]一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法

权利要求书

1.一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分别提取啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1、可溶性麸质蛋白组分F2以及啤酒中的多肽组分F3，包括如下步骤：

①啤酒经过放置、超声处理进行消泡，将消泡后的啤酒加入截留分子质量为3kDa的超滤管中浓缩；

②超滤管外衬管中的溶液，即为啤酒中的多肽组分F3；

③取超滤管内衬管中的溶液，按体积比为1:3～4加入-20℃～-25℃的0.1M醋酸铵甲醇或0.1M醋酸铵体积比50％甲醇水溶液或体积比50％异丙醇水溶液或体积比80％异丙醇水溶液或体积比60％乙醇水溶液中，于-20℃～-25℃提取反应8h～20h；

④离心、分离沉淀和上清液，沉淀用丙酮清洗3～4次，风干，即得不溶性麸质蛋白组分F1；

⑤步骤④所述上清液加入-20℃的丙酮后，于-20℃～-25℃提取2h～10h，所得沉淀用丙酮清洗3～5次；离心，弃上清，风干，即得可溶性麸质蛋白组分F2；

(2)将步骤(1)得到的F1和F2进行酶解，F3进行除盐；

(3)将酶解后的麸质蛋白组分F1和F2，以及除盐后的F3分别进行液相-质谱分析；

(4)以Sequest HT为搜索引擎，采用Proteome Discoverer软件对液相-质谱分析结果进行检索，通过与Uniprot数据库中的禾本科植物进行比对，完成麸质蛋白的鉴定；

(5)麸质蛋白的绝对定量：

a)挑选麸质蛋白的标准肽段，所述标准肽段序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示；

b)合成步骤a)中的标准肽段；

c)将组分F1、组分F2和组分F3分别进行液相-质谱分析；

d)将步骤c)得到的数据导入Skyline软件，即可得到麸质肽段的母离子的相对定量值；

e)将步骤b)得到的标准肽段分别以不同浓度分别进行液相-质谱分析；

f)将步骤e)得到的数据导入Skyline软件，得到每条标准肽段对应的响应值，根据响应值所对应的浓度制作各标准肽段的标准曲线；

g)将步骤d)得到的相对定量值带入步骤f)得到的标准曲线，从而得到每种麸质蛋白的绝对定量值；

液相条件：通过75μm i.d.×12cm的C18毛细管分析柱进行分离；流动相A：0.1％FA，B：80％ACN 0.1％FA；洗脱程序：0-10min 4％B；10-13min 4-10％B；13-35min10-35％B；35-41min 35-55％B；41-42min 55-95％B；42-52min 95％B；52-53min 95-4％B；53-70min 4％B。

2.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤①中的浓缩采取方式为4000g 4℃～10℃离心40～70min；所述步骤④与步骤⑤所采取的离心条件为8000g 4℃～10℃离心10～20min。

3.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤(2)中的F1和F2进行酶解，具体包括如下步骤：

①将F1与F2分别溶于6M盐酸胍10mM～50mM Tris-Hcl PH＝8.0～8.2缓冲液中；

②分别将步骤①所得F1和F2装入截留分子质量为10kDa的超滤管中，分别加入100mmol/L二硫苏糖醇至浓度为20mmol/L，混匀后45℃～60℃孵育1h～1.5h后离心弃上清；

③分别加入100mmol/L碘乙酰胺至浓度为20mmol/L，避光反应40～45min后离心弃上清；

④沉淀物分别用10mmol/L的NH₄HCO₃清洗3～4次，离心弃上清；

⑤按照质量比为1:30～50的比例加入胰蛋白酶或糜蛋白酶，37℃酶解12h～24h；离心，收集外衬管中溶液。

4.根据权利要求3所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤①-④中的离心条件均为14000g，室温，离心20～30min。