[发明专利]一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法

说明书

本发明公开了一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，属于麸质蛋白的检测技术领域。本发明啤酒中麸质蛋白绝对定量的方法，包括如下步骤：(1)分别提取啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1和可溶性麸质蛋白组分F2；啤酒中的多肽F3(2)将步骤(1)得到的F1和F2进行酶解；F3进行除盐(3)将酶解后的麸质蛋白组分F1，F2和F3分别进行液相‑质谱分析；(4)进行麸质蛋白的鉴定；(5)麸质蛋白的绝对定量。本发明所述方法灵敏度高，可同时检测多种类型的麸质蛋白，精确度高，假阳性结果概率低。

技术领域

本发明属于麸质蛋白的检测技术领域，具体涉及一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法。

背景技术

麸质蛋白是小麦，大麦，燕麦等禾本科家族中重要的储存蛋白复合物总称，存在于种子的胚乳中约占蛋白质总量的70-80％。前人按照此类蛋白的溶解度特点，将其分为可溶性醇组分和不溶于醇组分。谷类种子醇溶蛋白富含脯氨酸和谷氨酰胺，称为醇溶蛋白。醇溶蛋白包括：小麦中的麦醇溶蛋白(gliadin)和麦谷蛋白(glutenin)；大麦中的角蛋白(hordein)；黑麦中的醇溶蛋白(secalin)和燕麦中的燕麦蛋白(avenin)；高分子量谷蛋白(HMW-GS)和低分子量谷蛋白(LMW-GS)属于小麦的麦谷蛋白。不溶于醇组分的蛋白通常被认为是醇溶性蛋白质，因为在种子萌发过程中硫氧还蛋白的含量的变化，从而影响蛋白质结构中的二硫键在醇中的溶解度。

麸质蛋白是一类特殊的食品致敏原成分，也是国际上最早关注和研究的食品过敏原。乳糜泻患者对此类蛋白异常敏感是因为这类患者体内分解麦醇溶蛋白细胞酶活性较低，不能充分水解致病性植物蛋白抗原致使其与其他蛋白发生了免疫交叉反应。常见的临床症状包括：腹泻，食欲不振，骨质疏松等。据报道乳糜泻常与自身免疫性疾病有关，如Ⅰ型糖尿病。同时还与肠恶性肿瘤发病率相关，如肠癌，肠T细胞淋巴癌。近年来，相关疾病发病率日益增加，严重影响部分人群的生活质量。从而成为全球性需要解决的食品安全问题之一，引发人们的广泛关注。麸质蛋白广泛存在于啤酒，面包，酱油，饼干等食品中，是人们摄取蛋白质的重要来源。如今人们开发了几种治疗乳糜泻的方法，但效果不理想，目前唯一有效的治疗方法是严格的终身无麸质饮食。

啤酒是以大麦、小麦等含免疫原蛋白的谷类食品为主要原料发酵而成的饮料。在糖化，发酵过程中葡聚糖酶、蛋白酶、α-淀粉酶等一些酶可以将此类蛋白进行不同程度的降解，这将给提取过程带来了很大的难度。ELISA技术被证明是非常有效的检测麸质蛋白的方法，但在生产过程中麸质蛋白可能降解成肽段，影响其免疫表位的检测，从而不能精准的检测麸质蛋白的含量。目前，报道出两种酶联免疫吸附试验(ELISA)是最有效的分析麸质蛋白的方法。一种是抗黑麦(secalin)的单克隆抗体R5，它可以检测含有QQFP、QQQFP、LQPFP和QLPFP的氨基酸序列；另一种是针对检测ω-gliadins中含有PQPQPFPQE和PQQPPFPEE的表位。目前只研发出两种抗体对其进行检测，因抗体有限不能同时检测到多类麸质蛋白，容易出现假阳性和假阴性的结果，定量限最低在15ppm左右，与定义无麸质食品的定量限相同，对于含有低含量的麸质蛋白的食品，用此方法检测带来很大的难度。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种可以快速高效率的提取啤酒中麸质蛋白的方法，并且通过质谱与平行反应监测法(LC-PRM)对麸质蛋白中的特异性肽段进行绝对定量。经实验证明，本发明最多可以检测到一种啤酒中有256个麸质蛋白，通过LC-PRM方法对检测限为0.1ppt-1ppb范围内。本发明检测灵敏度高，即使采用1毫升的样品，仍可以检测到特异性肽段标记物。

本发明提供了一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，具体包括如下步骤：

(1)分别提取啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1、可溶性麸质蛋白组分F2以及啤酒中的多肽组分F3；

(2)将步骤(1)得到的F1和F2进行酶解，F3进行除盐；

(3)将酶解后的麸质蛋白组分F1和F2，以及除盐后的F3分别进行液相-质谱分析；