[发明专利]一种检测食管鳞癌癌组织与癌旁组织差异菌群的引物组、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种检测食管鳞癌癌组织与癌旁组织差异菌群的引物组，所述引物组包括上游引物341F和下游引物806R；所述上游引物341F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种包括权利要求1所述引物组的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×Phusion MasterMix和双蒸水。

4.一种基于权利要求1所述引物组或权利要求2或3所述试剂盒的非诊断目的的检测食管鳞癌癌组织与癌旁组织差异菌群的方法，包括以下步骤：

1)分别提取食管鳞癌患者的癌组织和癌旁组织中的菌群基因组DNA；

2)分别以癌组织中的菌群基因组DNA和癌旁组织中的菌群基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

3)对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择主带大小在400～450bp之间的条带，切胶回收，得到目标条带；

4)利用所述目标条带构建文库，进行测序，得到癌组织和癌旁组织菌群测序数据；

5)对所述癌组织和癌旁组织菌群测序数据进行质量控制，得到质控后的数据；

6)将所述质控后的数据导入Qiime2019.4软件，使用DADA2算法降噪得到特异性扩增子，过滤总序列数低于10或出现在少于5例样本中的特异性扩增子，应用分类器比对Greengenes13.8数据库，对代表性特异性扩增子进行物种注释，得到物种注释后的数据；

7)采用Qiime2019.4软件对物种注释后的数据进行分析，分别计算癌组织和癌旁组织菌群的Alpha多样性、Beta多样性和相对丰度，得到计算结果；

8)统计计算结果，筛选得到食管鳞癌癌组织与癌旁组织的差异菌群。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR扩增反应的体系以30μL计包括：2×Phusion Master Mix 15μL、模板10μL、上游引物341F 1μL、下游引物806R 1μL和无菌双蒸水3μL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上游引物341F和下游引物806R的浓度分别为10μmol/L。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR扩增反应的程序为：98℃、1min；98℃、10s，50℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、5min。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤6)所述对所述癌组织和癌旁组织菌群测序数据进行质量控制，包括以下步骤：

S1.去除所述癌组织和癌旁组织菌群测序数据的3’端引物接头，根据PE reads之间的重复关系将成对的序列拼接成一条序列，得到第一样品序列；

S2.通过标签序列区分第一样品序列，去除标签序列、重叠区域出现两个及以上错配碱基、错误率高于1％、片段长度低于200bp的序列，得到第二样品序列；

S3.去除第二样品序列中的嵌合体，得到待分析的癌组织和癌旁组织菌群测序数据。