[发明专利]一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法

说明书

本发明提供了一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法，属于转基因鱼研究与生产技术领域，所述溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g。采用本发明提供的溶液能够延长鱼卵受精孔的开放时间，以方便外源基因直接进入鱼卵。

技术领域

本发明属于转基因鱼研究与生产技术领域，尤其涉及一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法。

背景技术

现在常见的导入技术有：显微注射法、精子携带法和点穿孔法等。其中显微注射法是目前最常用和比较有效的基因导入方法。显微注射法是最先采用的转基因方法，被广泛应用并取得了较好的结果。其方法为在显微镜下，用直径几微米的玻璃细针插入受精卵中，注入一定量的外源基因，注射后的受精卵于室温下在生理盐水中发育成鱼苗。

显微注射的缺点是：鱼卵外壳的完整受到破坏，显微注射后的卵死亡率较高；显微注射对注射时间要求比较严格，必须在受精后二至十六细胞期间注射，否则容易产生嵌合体；显微注射效率不高，一次能操作的鱼卵数量较少；对注射人来说技术难度较高。

精子携带法的缺点：精子和外源DNA结合效率不高，而且不稳定，会造成不同批次的转基因鱼阳性比例不稳定。外源DNA通过精子导入到受精卵后被降解的几率比较高，不太容易整合到基因组中。

鱼卵的外壳有受精孔，是精子进入鱼卵的通道，其大小与精子相当，一般是导入外源DNA直径的几十到几百倍大小的，所以外源DNA很容易通过受精孔进入未受精的卵。但是受精孔在鱼卵进入自然环境后，鱼卵壳很快会吸水膨胀，受精孔消失。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法，采用本发明提供的溶液能够延长鱼卵受精孔开放的时间，有助于外源基因导入鱼卵中。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液，所述溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g。

优选的，所述水为蒸馏水。

本发明还提供了一种利用受精孔导入外源基因的方法，包括以下步骤：

1)将上述技术方案所述的溶液与阳离子脂质体Lipofecter、外源基因混合，得到混合溶液；

2)将所述步骤1)得到的混合溶液与鱼卵混合后振荡10～30min。

优选的，所述步骤1)溶液与阳离子脂质体Lipofecter的体积比为1:0.1。

优选的，所述步骤2)混合溶液的体积与鱼卵的个数比为4ml:1000个。

优选的，所述步骤2)振荡的时间为20min。

优选的，所述步骤2)振荡的速度为60转/min。

优选的，所述鱼卵为罗非鱼或鲤鱼的鱼卵。

本发明提供了一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液，所述溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g。采用本发明提供的溶液能够延长鱼卵受精孔的开放时间，以方便外源基因直接进入鱼卵。在本发明中，所述溶液和鱼类体液成份接近，盐浓度相当，在本溶液中鱼卵可以不吸水而保持原样，让受精孔一直开放。

本发明和现有技术相比有如下优点：

1、和显微注射相比对鱼卵伤害很小；

2、和显微注射相比对实施人员技术要求较低；