[发明专利]一种双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法

权利要求书

1.一种双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将重组菌株E.coli BL-22AB和重组菌株E.coli BL-YDT分别进行培养，离心，得到重组菌株E.coli BL-22AB菌泥和重组菌株E.coli BL-YDT菌泥；

(2)用PBS缓冲液将步骤(1)得到的重组菌株E.coli BL-22AB菌泥重悬，得到重悬液；向重悬液中加入表面活性剂，搅拌，得到通透性增加的重组菌株E.coli BL-22AB细胞溶液；

(3)将步骤(2)得到的通透性增加的重组菌株E.coli BL-22AB细胞溶液中与多巴胺溶液混合，一次搅拌，再向其中加入甘露糖溶液，二次搅拌，离心，得到通透性修饰后具有表面粘附涂层的重组菌株E.coli BL-22AB菌泥；

(4)用PBS缓冲液将步骤(1)得到的重组菌E.coliBL-YDT菌泥重悬，得到细胞溶液A；用PBS缓冲液将步骤(3)得到的通透性修饰后具有表面粘附涂层的重组菌株E.coli BL-22AB菌泥重悬，得到细胞溶液B；将细胞溶液A与细胞溶液B混合，一次搅拌，加入多巴胺溶液，二次搅拌，离心，得到耦合粘附菌泥；

(5)用PBS缓冲液将步骤(4)得到的耦合粘附菌泥重悬，得到重悬液；向重悬液中加入L-赖氨酸溶液和α-酮戊二酸溶液，催化反应，离心，所得上清液即为含有戊二酸的液体。

2.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，用PBS缓冲液将步骤(1)得到的重组菌株E.coliBL-22AB菌泥重悬至OD₆₀₀为1～10。

3.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的表面活性剂为吐温类表面活性剂、司班类表面活性剂、曲拉通X-100中的任意一种；控制表面活性剂的添加量，使表面活性剂的体积浓度为0.5％～2％。

4.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，多巴胺溶液中多巴胺的浓度为0.1～2.5g/L，多巴胺溶液的溶剂为pH 7.5Tris-HCl缓冲液；步骤(2)得到的通透性增加的重组菌株E.coli BL-22AB细胞溶液与多巴胺溶液的体积比为1:1～1:3。

5.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的甘露糖溶液中甘露糖的浓度为0.5～3g/L，甘露糖溶液的溶剂为水；甘露糖溶液与多巴胺溶液的体积比为1:1～1:5。

6.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(4)中，细胞溶液A的OD₆₀₀为2～10；细胞溶液B的OD₆₀₀为5～10；多巴胺溶液中多巴胺的浓度为0.1～2.5g/L，多巴胺溶液的溶剂为pH 7.5Tris-HCl缓冲液。

7.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(4)中，细胞溶液A与细胞溶液B按照体积比为1:1混合；多巴胺溶液与细胞溶液A的体积比为1:1～1:3。

8.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(5)中，用PBS缓冲液将步骤(4)得到的耦合粘附菌泥重悬至体系中E.coli BL-22AB和E.coliBL-YDT的细胞溶液浓度均为OD₆₀₀＝5～10。

9.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述L-赖氨酸溶液和α-酮戊二酸溶液的pH值均为7.0，溶剂为PBS缓冲液；控制L-赖氨酸溶液和α-酮戊二酸溶液的添加量，使体系中L-赖氨酸和α-酮戊二酸的终浓度均为10～60g/L。

10.根据权利要求1所述的双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的催化反应为在37℃下反应30～60h。