[发明专利]一种双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法

说明书

本发明公开了一种双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，其包括如下步骤：(1)用PBS缓冲液将重组菌株E.coli BL‑22AB菌泥重悬，再加入表面活性剂，搅拌；(2)将步骤(1)得到的物料与多巴胺溶液混合，搅拌，再向其中加入甘露糖溶液，搅拌，离心，得到菌泥；(3)用PBS缓冲液将重组菌E.coli BL‑YDT菌泥重悬，得到细胞溶液A；用PBS缓冲液将步骤(2)得到的菌泥重悬，得到细胞溶液B；将细胞溶液A与细胞溶液B混合，搅拌，加入多巴胺溶液，搅拌，离心，得到耦合粘附菌泥；(4)用PBS缓冲液将耦合粘附菌泥重悬，再加入L‑赖氨酸溶液和α‑酮戊二酸溶液，反应，离心，即得。

技术领域

本发明属于微生物细胞催化、戊二酸生产技术领域，具体涉及一种双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法。

背景技术

戊二酸是一种重要的碳五平台化学品，在聚酰胺材料领域具有广泛用途，还可以用作增塑剂、腐蚀抑制剂、刚柔性镧系配位聚合物等材料领域。化学合成戊二酸的过程存在原料昂贵、污染严重、转化率低等问题，生物合成戊二酸近年来受到广泛关注。在微生物体内，戊二酸可由L-赖氨酸经5-氨基戊酸(5-AMV)途径分解代谢产生。全细胞催化L-赖氨酸合成戊二酸过程中中间代谢产物5-氨基戊酸积累严重，生产效率低下等问题，通过建立基于两个重组菌株(E.coli BL21-22AB和E.coli BL21-YDT)的双细胞耦合催化体系，优化蛋白表达，强化催化过程，分批补料解决底物抑制等手段，提高了戊二酸的产量。双细胞耦合的全细胞催化体系，降低了中间产物积累和多基因共表达相互影响；并进一步通过表达L-谷氨酸氧化酶催化L-谷氨酸合成α-酮戊二酸，构建全细胞催化共底物α-酮戊二酸的循环再生系统，降低过程成本，为戊二酸的高效生物合成提供指导。

然而在实际的应用过程中，两种细胞之间的耦合作用依靠分细胞泌物溶解在反应介质中进行传质，因此提高双细胞耦合作用的关键难点在于提高两种细胞之间的传质效率。目前，多种聚合物涂层已有报道在黏附微生物上进行很好的附着，其次基于蛋白与多糖之间的特异性吸附原理，本发明开发了一种双细胞的黏附耦合技术，直接将两种细胞黏附在一起，降低了反应物质的传质距离。双细胞黏附耦合技术在提高两种细胞之间的传质效率的同时，提高了双细胞的耐受性，最终提升了戊二酸的产量。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中双细胞耦合作用时，两种细胞之间的传质效率低导致的催化效果差，提供一种双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，该方法对于戊二酸的产量有了明显的提升，并且显著提升了双细胞生物催化剂的使用性能。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种双细胞粘附耦合法生产戊二酸的方法，在收集的第一种微生物细胞悬液中添加表面活性剂，提高微生物细胞细胞膜的通透性后，除去表面活性剂溶液，添加聚合物和甘露糖，即得到细胞膜通透性增加且具有吸附/粘性涂层的第一种微生物细胞。而后与第二种微生物细胞混合，两种微生物细胞发生黏附作用后，继续添加聚合物，提高黏附效果，最终得到两种细胞黏附耦合的生物催化剂。这种双细胞黏附耦合技术，降低了两种细胞之间的物质传质距离，提升生物催化过程中的耐受性，最终提升戊二酸的产量；其中双细胞黏附过程使用到的聚合物为多巴胺(多巴胺聚合物生物亲和性高且便宜)自聚合生成的聚多巴胺。一般来说，加入表面活性剂即导致细胞膜通透性提升、细胞耐受性下降，不利于细胞长时间催化，固本发明采用聚多巴胺进行修饰。

具体的，其包括如下步骤：

(1)将重组菌株E.coli BL-22AB和重组菌株E.coli BL-YDT分别进行培养，离心，得到重组菌株E.coli BL-22AB菌泥和重组菌株E.coli BL-YDT菌泥；

(2)用PBS缓冲液将步骤(1)得到的重组菌株E.coli BL-22AB菌泥重悬，得到重悬液；向重悬液中加入表面活性剂，搅拌，得到通透性增加的重组菌株E.coli BL-22AB细胞溶液；