[发明专利]一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，具体实施过程主要包括gRNA靶位点选取、显微注射及F0代鼠的鉴定、纯合子繁殖和鉴定三个部分，能够成功获得ABCC4基因全身性敲除的纯合小鼠；本发明获得的ABCC4基因敲除的纯合小鼠可用于慢阻肺疾病模型制作，为ABCC4影响纤毛生长在慢阻肺发生发展中的功能作用等方面的研究提供可靠的动物模型；本发明提供的gRNA靶位点序列具有较低的脱靶效应，能够被成功切割，在构建ABCC4基因敲除小鼠的过程中具有关键作用；与传统的基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9能够实现基因定点修饰，操作简单易行高效，且发生同源重组的概率较高，缩短构建模型小鼠所需的时间，提高基因敲除的准确性和效率。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，特别涉及一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法及其应用。

背景技术

ABCC4是ATP结合转运蛋白家族一员，在各种血细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞中均有表达，可定位于基底外侧膜或顶膜，发挥物质主动运输的作用。ABCC4运输物质比较广泛，包括细胞信号通路中的关键分子如环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)和前列腺素等。ABCC4参与调节细胞内cAMP浓度。cAMP作为第二信使在不同的细胞功能中起到关键作用，包括调节内皮屏障，收缩平滑肌细胞和激活炎症细胞等。目前认为，提高细胞内cAMP水平是治疗炎症性肺病的策略。另外，ABCC4蛋白可以直接转运前列腺素，参与前列腺素信号通路在纤毛生长中的作用。在人类视网膜色素上皮细胞和小鼠肾脏内髓集合管细胞中降低ABCC4表达，都表现出纤毛数目减少和长度变短的表型。2017版慢性阻塞性肺疾病全球倡议指出，吸烟或其他有害因素会引起慢阻肺患者的气道纤毛清除功能下降，导致细菌定植在呼吸道，粘液分泌增多，持续刺激机体免疫反应，促进慢阻肺进展。我们的前期研究结果发现，ABCC4基因的SNP位点与慢阻肺患病风险有关，且引起慢阻肺患者血液中ABCC4表达水平下降。为了进一步证明ABCC4表达水平下降对慢阻肺发生发展的影响，需要构建ABCC4基因敲除小鼠，并进行慢阻肺疾病模型制作，为研究ABCC4影响纤毛生长机制，促进慢阻肺发生发展的作用提供动物模型。

CRISPR/Cas9技术是第三代人工核酸内切酶技术。与传统的锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9通过设计不同的向导RNA对基因进行定点修饰，操作简单、易行、高效，基因修饰可遗传、无物种限制、实验周期较短、成本较低，且发生同源重组的概率比自然发生同源重组的概率高。利用CRISPR/Cas9技术成功地在人类、小鼠、斑马鱼以及植物等物种上实现精确的基因修饰后，科学家们也在不断探索这种技术在疾病治疗中应用的可能性。目前，利用CRISPR/Cas9技术能体外修复镰刀型贫血症患者来源造血干细胞的人β珠蛋白第1个外显子上的1个碱基突变位点；建立亨廷顿病猪基因敲入模型，并且能够很好地模拟人神经退行性疾病患者的表型；治疗跨膜通道样基因家族1突变的听力失聪的小鼠模型等。但是，目前缺少在慢阻肺疾病领域的研究和应用。

动物模型是疾病研究中至关重要的部分，任何疾病研究都需要在动物模型上先进行试验。CRISPR/Cas9技术可以人为对动物体进行基因编辑，制备疾病模型。目前，利用CRISPR/Cas9技术已建立多种动物疾病模型，如B型血友病小鼠遗传病模型、靶向编辑的免疫缺陷型小鼠模型、肝癌等小鼠肿瘤动物模型、自闭症食蟹猴模型以及亨廷顿舞蹈病基因敲入猪模型等。这些动物疾病模型的建立为药物筛选及治疗研究奠定了扎实的基础。综上，为了研究ABCC4引起慢阻肺发生发展的机制，制备ABCC4基因敲除小鼠是必不可少的，也是制备慢阻肺疾病小鼠模型的前提。

发明内容

本发明采用CRISPR/Cas9技术在小鼠受精卵上进行基因打靶，实现ABCC4基因敲除，然后通过显微注射和配繁获得ABCC4全身性基因敲除的纯合小鼠。此小鼠会进一步熏烟制备慢阻肺疾病模型，为探究ABCC4在慢阻肺发生发展中的作用机制奠定基础。