[发明专利]一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法及其应用

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

步骤一、gRNA靶位点选取：在ABCC4基因2号外显子上游2000bp内和3号外显子下游2000bp内非串联重复序列处选取gRNA靶位点，并设计合成gRNA；

步骤二、获得阳性F0代小鼠：将Cas9蛋白和合成的gRNA直接注射到C57BL/6N小鼠受精卵后，移植入代孕母鼠输卵管中，待小鼠出生后剪取鼠尾进行PCR鉴定，获得阳性F0代小鼠；

步骤三、纯合子繁殖和鉴定：将性成熟的阳性F0代鼠分别与野生型鼠配繁一代，获得子代剪取鼠尾提取基因组DNA进行PCR鉴定，得F1代杂合子，将获得的性成熟的F1代杂合子自交，进行纯合子繁殖。

2.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，其特征在于：所述步骤一中所述gRNA靶位点序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，其特征在于：所述步骤二待小鼠出生后剪取鼠尾进行PCR鉴定包括提取小鼠鼠尾基因组DNA以及PCR鉴定。

4.根据权利要求3所述的一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，其特征在于：所述提取小鼠鼠尾基因组DNA步骤为：

(1)剪取2-5mm鼠尾组织置于1.5mL离心管中，加入180μL Buffer GL、20μL蛋白酶K和10μL RNA酶A；

(2)56℃孵育过夜；

(3)12000rpm离心2分钟，弃去杂质；

(4)加入200μL Buffer GB和200μL无水乙醇，充分混匀；

(5)将试剂盒配套的离心柱置于收集管中，将样品转移至离心柱中，12000rpm离心2分钟，弃去收集管中的液体；

(6)向离心柱中加入500μL Buffer WA，12000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；

(7)向离心柱中加入700μL Buffer WB，12000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；

(8)重复步骤(7)；

(9)将离心柱置于收集管中，12000rpm离心2min；

(10)将离心柱置于一个新1.5mL离心管中，向离心柱膜中央加入50-200μL无菌水，静置5min；

(11)12000rpm离心2min，为了提高DNA产率，可以重复步骤(10)；

(12)琼脂糖凝胶电泳检测。

5.根据权利要求3所述的一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，其特征在于：所述PCR鉴定所需引物序列如序列表中SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求5所述的一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，其特征在于：所述PCR鉴定所需引物F1R1扩增出条带大小为434bp，F1R2扩增出条带大小为592bp，内源性小鼠Rgs7基因为内参，PCR反应所得产物的电泳条带大小为335bp，琼脂糖凝胶电泳时，使用100bp DNA Ladder Marker(Thermo Scientific，SM0242)作为参照。

7.根据权利要求5所述的一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，其特征在于：所述PCR鉴定按照表3配置25μLPCR反应体系，以提取的鼠尾基因组DNA为模板，使用引物F1R1按照表4进行PCR扩增，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得434bp大小条带即鉴定为阳性。

8.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9技术构建ABCC4基因敲除小鼠的方法，其特征在于：所述步骤三中PCR鉴定时，同时含有434bp和592bp大小的电泳条带即鉴定为杂合子，仅有434bp大小的电泳条带即鉴定为纯合子。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法构建的ABCC4基因敲除小鼠的应用，其特征在于：用于慢阻肺疾病模型制作，为研究ABCC4基因在纤毛发育中的功能，对维持气道稳态的影响及其在慢阻肺发生发展中的作用方面的研究提供可靠的动物模型。