[发明专利]高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法及其应用于聚普瑞锌的质量评价

说明书

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种高效毛细管电泳测定L‑肌肽的方法，包括：（1）取L‑肌肽溶解于缓冲液中制得对照品原液，分别量取对照品原液若干于10 mL量瓶中，定容得到系列浓度对照品溶液，4℃储存；（2）采用高效毛细管电泳对系列浓度对照品溶液进样检测，记录色谱图，以分析物的峰面积A为纵坐标，对照品溶液的浓度C为横坐标，绘制标准曲线；（3）待测样品经预处理后经高效毛细管电泳测得峰面积，根据标准曲线测得L‑肌肽的含量。本发明所公开方法高效、简便、灵敏度高，快捷准确，不使用有机溶剂，环保高效，测定结果快速准确、重复性好，可在10min内完成测定，为聚普瑞锌原料药及其制剂的质量评价提供了经济、环保、高效的技术手段。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及L-肌肽的测定，尤其涉及一种高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法及其应用于聚普瑞锌的质量评价。

背景技术

聚普瑞锌(Polaprezinc，PZ)是锌和L-肌肽的螯合物，属于促进防御因子类药，由日本Hamari新药工业株式会社开发的抗胃溃疡药物。锌及L-肌肽均可加速胃黏膜损伤愈合，锌主要通过促进细胞增殖和蛋白合成加速各类型组织的伤口愈合进程，L-肌肽是一种由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽，具有抗氧化作用，对自由基和金属离子引起的脂质氧化具有显著抑制作用。

作为锌与L-肌肽组成的不溶性复合物，相较于单独的锌或L-肌肽而言，聚普瑞锌在胃液中分解缓慢，能够在胃内长时间停留，持续发挥胃黏膜修复与保护作用以促进胃溃疡黏膜愈合。研究表明聚普瑞锌能明显降低炎症因子如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的水平，提高抗氧化酶的表达，如超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、SOD-2、血红素加氧酶(HO-1)、谷胱甘肽转移酶、PRX-1、PRX-5及生长因子(血小板源生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子)等。同时提高HSP90、70、60、47、27、10的表达水平发挥黏膜保护作用。其中，HSP70作为代表性热休克蛋白，通过抑制JNK信号通路、细胞凋亡蛋白酶活性、线粒体细胞色素C的释放及凋亡复合体的形成来发挥抗细胞凋亡的功能。临床试验显示，单独使用本品8周后，胃溃疡的痊愈率高达72.97％，总有效率为84.68％。

聚普瑞锌的溶解度实验表明其在0.1mol/L HCl中略溶，在0.1mol/L NaOH中极微溶解，在水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚、四氢呋喃、丙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺中几乎不溶。由于聚普瑞锌在大多数溶剂中的不溶性，其中万能溶剂也不例外，故截至目前，国内外尚未见直接测定聚普瑞锌含量的方法。

酸性条件下聚普瑞锌可水解为L-肌肽和锌离子，可通过测定L-肌肽的含量从而实现对聚普瑞锌的定量分析。目前，针对L-肌肽的分析检测方法多采用氨基酸分析仪法和高效液相色谱法。氨基酸分析仪从本质上来说是液相色谱的特殊应用，用氨基酸分析仪进行氨基酸分析前必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，然后用缓冲溶液推动氨基酸混合物流经装有阳离子交换树脂的色谱柱，各氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同的pH缓冲溶液进行洗脱时因交换能力的不同而将氨基酸混合物分离，分离出的单个氨基酸组分与茚三酮试剂反应，生成紫色化合物或黄色化合物，用可见光检测器检测其在570nm、440nm的吸光度。这些有色产物对应的吸收强度与洗脱出来的各氨基酸浓度之间的关系符合朗伯-比尔定律，从而实现对氨基酸的定量测定。但是离子交换树脂易压缩，流动相流速的加快不与压力的增加成比例，故所需的样品测定时间较长；且氨基酸经离子交换柱分离，在柱后与水合茚三酮衍生剂混合进行反应，造成柱后扩散比较大，峰形变宽，分辨率降低；另外由于氨基酸分析仪结构复杂，价格相对昂贵，并不是测定L-肌肽的首选方法。传统的反相液相色谱(RPLC)是目前应用最广泛的色谱分离技术，能够满足大部分非极性化合物的分离要求，但L-肌肽作为强极性化合物，在色谱柱上保留较弱甚至不保留，只能对其进行衍生化或加入离子对试剂。不可避免的是在衍生化过程中，容易引入新的杂质或衍生不完全造成样品的损失，另外形成的衍生副产物可能对色谱分离造成更大的困难。离子对试剂容易与固定结合产生不可逆吸附，进而影响固定相活性位点。而且离子对试剂很难从色谱柱上冲洗干净，造成色谱柱寿命大幅缩短的严重后果。