[发明专利]内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法。该表达载体以pCT74HSPG载体为基础载体，采用SEQ ID NO：1所示的Six1d基因启动子替换pCT74HSPG载体中的ToxA启动子。本发明构建的pSix1d74HSPG载体中的pSix1d启动子活性显著高于pCT74HSPG载体中的ToxA启动子活性，可以达到ToxA启动子活性的约1.6倍；新构建的pSix1d74HSPG载体完全可以取代原来的pCT74HSPG载体，利用内源启动子携带尖孢镰刀菌自身的基因侵染香蕉植株，为香蕉枯萎病的分子机理研究提供重要的实验基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法。

背景技术

香蕉枯萎病是危害香蕉产业的重要病害，而尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense,Foc)是引起这种病害的病原真菌。Foc有4个生理小种，其中，1号小种(Foc1)和4号小种(Foc4)在我国分布最为广泛。分泌蛋白作为一类重要的致病因子，在Foc侵染香蕉过程中起着重要作用。有研究表明，病原真菌的部分分泌蛋白在其与植物的互作中发挥关键作用，但具体的互作机理仍鲜见报道。

尖孢镰刀菌在与寄主的相互作用中会分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白(15.8～29.9kD)进入木质部中启动致病力，被称为Six(secreted in xylem)蛋白。目前为止，在Fol(番茄枯萎病菌)中已被鉴定到的Six蛋白从Six1到Six14，已有14个。本研究团队前期对尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种的分泌蛋白质组研究结果发现，Six1d蛋白是尖孢镰刀菌中高丰度分泌蛋白之一。为了详细研究Six1d蛋白在尖孢镰刀菌致病过程中的具体作用机制，本研究团队构建了74HSP-EGFP重组载体(详见申请号为201911247436X专利中公开的载体)，但该pCT74载体中ToxA启动子来自于真菌Pyrenophora triticirepentis，需要寻找一种活性相当甚至更强的尖孢镰刀菌内源启动子来驱动Six1d蛋白的表达。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体、Foc4转化菌及构建方法。该尖孢镰刀菌分泌表达载体中的pSix1d启动子活性显著高于74HSP-EGFP重组载体中的ToxA启动子活性，可以达到ToxA启动子活性的约1.6倍。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种内源启动子驱动的尖孢镰刀菌分泌表达载体，以pCT74HSPG载体为基础载体，采用SEQ ID NO：1所示的Six1d基因启动子替换pCT74HSPG载体中的ToxA启动子。

本研究团队前期对尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种的分泌蛋白质组研究结果发现，Six1d蛋白是尖孢镰刀菌中高丰度表达的分泌蛋白之一。为了详细研究Six蛋白及其它分泌蛋白在尖孢镰刀菌致病过程中的具体作用机制，本研究克隆了Six1d基因的启动子，将本研究团队已改进的一种真菌分泌表达载体中的组成型表达启动子ToxA进行替换，构建尖孢镰刀菌自身启动子驱动的一种真菌分泌表达载体；通过比较ToxA启动子和pSix1d基因启动子驱动表达的绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)表达丰度，以及荧光强度，来验证Six1d基因启动子的活性，为后续研究尖孢镰刀菌蛋白与香蕉的互作机理提供重要的实验基础。

作为优选，pCT74HSPG载体为：在pCT74载体的4665bp处插入Six1d分泌蛋白N端23aa的胞外信号肽的真菌分泌型表达载体74HSP。

作为优选，胞外信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

作为优选，胞外信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明中，Six1d基因启动子来源于尖孢镰刀菌1号生理小种的基因组。