[发明专利]发根农杆菌介导南瓜根系转化方法及基因编辑方法

说明书

本发明涉及一种发根农杆菌介导南瓜根系转化方法及基因编辑方法，通过特定工艺步骤首次实现利用发根农杆菌介导南瓜根系转化，并实现对转化根系的基因编辑，便于促进对南瓜进行分子生物学和基因功能研究。

技术领域

本发明涉及植物技术领域，尤其涉及一种发根农杆菌介导南瓜根系转化方法及基因编辑方法。

背景技术

葫芦科是世界上最重要的食用植物科之一，包括黄瓜、南瓜、丝瓜、西瓜等常见的蔬菜和瓜果。其中，南瓜的果实、幼嫩茎叶、花都可食用，营养价值高，具有一定保健功能。同时南瓜具有耐贫瘠、抗逆性好等优势，还可用作西瓜、甜瓜、黄瓜等其它葫芦科作物的砧木，解决连作障碍等问题。

然而，目前并没有针对南瓜根系转化的报道，不利于推进南瓜分子生物学和基因功能的研究。

发明内容

基于此，有必要提供一种发根农杆菌介导南瓜根系转化方法及基因编辑方法，首次实现南瓜根系转化，并有利于促进对南瓜进行分子生物学和基因功能研究。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种发根农杆菌介导南瓜根系转化方法，包括如下步骤：

获取含子叶基部和胚轴连接区段的外植体；

采用含发根农杆菌Ar-qual的侵染液浸润外植体，并将浸润后的外植体置于共培养培养基中，于23±2℃、黑暗条件下共培养，浸染，得侵染后的外植体；

将侵染后的外植体转移至生根培养基中，于光强100±10μmol/m²/s²、光周期14±0.5h/10±0.5h、温度25±3℃条件下培养8-10天，挑出生根外植体并去除其上的第一批新生根系，再置于新鲜生根培养基中和相同外在环境条件下继续培养至第二批新生根系生长，得具有转化根系的南瓜组培苗。

优选地，所述共培养培养基为含100μM乙酰丁香酮、3％蔗糖和0.7％琼脂的MS培养基；所述生根培养基为含1％蔗糖、200mg/L TMT和0.3％植物凝胶的MS培养基。

在其中一个实施例中，所述的发根农杆菌介导南瓜根系转化方法还包括对南瓜组培苗进行炼苗的步骤：

将具有转化根系的南瓜组培苗定植于装有灭菌河沙并用透明塑料罩密封的穴盘中，于光强100±10μmol/m²/s²、光周期14±0.5h/10±0.5h、温度25±3℃条件继续培养3-5天，通风，继续培养，得具有转化根系的健壮南瓜苗。

在其中一个实施例中，获取含子叶基部和胚轴连接区段的外植体的步骤为：

选取饱满南瓜种子灭菌，再置于添加有含蔗糖的1/2MS培养基的组培瓶中，于28±5℃条件下催芽至胚轴伸长，再在光照条件下培养至子叶转为绿色，取出，切割。

在其中一个实施例中选取饱满南瓜种子灭菌的步骤为：将南瓜种子置于55±5℃热水中浸泡2-4h，去种壳，次氯酸钠溶液消毒种子，无菌水冲洗，获得与种皮分离的种仁。

进一步地，所述发根农杆菌Ar-qual还含携带GUS和GFP两套标记基因的载体pCAMBIA1305.4。

本发明还提供一种南瓜根系基因编辑方法，包括如下步骤：

利用含Cas9蛋白、sgRNA表达框的载体pKSE402制备含sgRNA序列的基因编辑载体，转化大肠杆菌，抽提阳性菌株的pKSE402质粒；

构建含pKSE402质粒的发根农杆菌Ar-qual；

按照上述所述的发根农杆菌介导南瓜根系转化方法进行南瓜根系转化，获得具有基因编辑根系的南瓜苗。