[发明专利]发根农杆菌介导南瓜根系转化方法及基因编辑方法

权利要求书

1.一种发根农杆菌介导南瓜根系转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取含子叶基部和胚轴连接区段的外植体；

采用含发根农杆菌Ar-qual的侵染液浸润外植体，并将浸润后的外植体置于共培养培养基中，于23±2℃、黑暗条件下共培养，浸染，得侵染后的外植体；

将侵染后的外植体转移至生根培养基中，于光强100±10μmol/m²/s²、光周期14±0.5h/10±0.5h、温度25±3℃条件下培养8-10天，挑出生根外植体并去除其上的第一批新生根系，再置于新鲜生根培养基中和相同外在环境条件下继续培养至第二批新生根系生长，得具有转化根系的南瓜组培苗。

2.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导南瓜根系转化方法，其特征在于，所述共培养培养基为含100μM乙酰丁香酮、3％蔗糖和0.7％琼脂的MS培养基；和/或

所述生根培养基为含1％蔗糖、200mg/L TMT和0.3％植物凝胶的MS培养基。

3.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导南瓜根系转化方法，其特征在于，还包括对南瓜组培苗进行炼苗的步骤：

将具有转化根系的南瓜组培苗定植于装有灭菌河沙并用透明塑料罩密封的穴盘中，于光强100±10μmol/m²/s²、光周期14±0.5h/10±0.5h、温度25±3℃条件继续培养3-5天，通风，继续培养，得具有转化根系的健壮南瓜苗。

4.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导南瓜根系转化方法，其特征在于，获取含子叶基部和胚轴连接区段的外植体的步骤为：

选取饱满南瓜种子灭菌，再置于添加有含蔗糖的1/2MS培养基的组培瓶中，于28±5℃条件下催芽至胚轴伸长，再在光照条件下培养至子叶转为绿色，取出，切割。

5.根据权利要求4所述的发根农杆菌介导南瓜根系转化方法，其特征在于，选取饱满南瓜种子灭菌的步骤为：将南瓜种子置于55±5℃热水中浸泡2-4h，去种壳，次氯酸钠溶液消毒种子，无菌水冲洗，获得与种皮分离的种仁。

6.根据权利要求1至5任一项所述的发根农杆菌介导南瓜根系转化方法，其特征在于，所述发根农杆菌Ar-qual还含携带GUS和GFP两套标记基因的载体pCAMBIA1305.4。

7.一种南瓜根系基因编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：

利用含Cas9蛋白、sgRNA表达框的载体pKSE402制备含sgRNA序列的基因编辑载体，转化大肠杆菌，抽提阳性菌株的pKSE402质粒；

构建含pKSE402质粒的发根农杆菌Ar-qual；

按照权利要求1至4任一项所述的发根农杆菌介导南瓜根系转化方法进行南瓜根系转化，获得具有基因编辑根系的南瓜苗。

8.根据权利要求7所述的南瓜根系基因编辑方法，其特征在于，所述sgRNA序列为针对CmoCh01G014300.1、CmoCh14G010850.1、CmoCh10G011690.1的NACsgRNA、RBOHsgRNA或NHXsgRNA。

9.根据权利要求8所述的南瓜根系基因编辑方法，其特征在于，所述NACsgRNA所对应的酶切连接体系用引物对序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述RBOHsgRNA所对应的酶切连接体系用引物对序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；

所述NHXsgRNA所对应的酶切连接体系用引物对序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。

10.根据权利要求8或9所述的南瓜根系基因编辑方法，其特征在于，还包括对采用含NACsgRNA的基因编辑载体编辑获得南瓜苗鉴定所采用的PCR引物对分别如下SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；

对采用含RBOHsgRNA的基因编辑载体编辑获得南瓜苗鉴定所采用的PCR引物对分别如下SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；

对采用含NHXsgRNA的基因编辑载体编辑获得南瓜苗鉴定所采用的PCR引物对分别如下SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示。